CRISPR Cas9敲入标记
通过使用CRISPR/Cas9基因编辑敲入感兴趣的内源性位点上的生物发光标签，可以使用简单的光输出测量来研究原生启动子表达的蛋白质。与过表达模型相比，内源性标记蛋白与天然相互作用的伙伴保持自然的表观遗传调控和化学计量，从而改善了分析窗口，减少了伪象，并在生理相关条件下建立了更精确的蛋白质生物学模型。
HiBiT是研究内源性蛋白质的常用标签。HiBiT是一种含有11个氨基酸的小肽，它与一种更大的亚基LgBiT具有高度亲和力。结合物具有较高的荧光素酶活性，并在添加的底物存在时产生明亮的发光信号。与较大的标签相比，HiBiT标签的小尺寸允许更高的敲入效率，不需要分子克隆步骤，使其非常适合CRISPR/Cas9编辑工作流程。
Promega为流行目标和细胞背景提供了crispr编辑细胞系池和克隆的全面选择。
利用CRISPR/Cas9敲入标记内源性基因座
结合CRISPR/Cas9敲入和活细胞生物发光检测方法，可以实时监测蛋白质丰度的变化，更好地了解细胞蛋白质动态。
为什么使用内生标记?
- 监测生理表达水平:无基因剂量效应
- 研究受原生启动子控制的基因及其表观遗传调控
- 保持化学计量与原生互动伙伴
使用CRISPR敲入监测蛋白质丰度、内化和调控
确定调节蛋白丰度
细胞蛋白质水平是由细胞条件的变化自然调节的，也可以作为一种治疗策略有目的地操纵它们。最近，靶向蛋白质降解已成为一种新的小分子模式，使以前无法降解的靶标能够被处理。使用CRISPR/Cas9基因编辑内源性插入生物发光标签，可以定量分析蛋白质丰度，而不需要目标特异性抗体。这些测定方法敏感且易于阅读，采用终点或活细胞格式，可对内源性靶蛋白水平进行详细分析。
内源性标记为HIF1A丰度分析创造了一个改进的分析窗口。用不同数量的CMV或pgk驱动的Hif1a-HiBiT表达构建瞬时转染HeLa细胞;另外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将HiBiT标记到HeLa细胞的内源性位点上。用1,10-菲罗啉滴定处理细胞，用纳米glo®HiBiT裂解试剂．
PROTAC处理后内源性HiBiT-BRD4的降解动力学。HiBiT插入内源性BRD4位点HEK293 LgBiT细胞系．细胞用MZ1滴定处理在二氧化碳无关的培养基含有纳米glo®Endurazine™基板．发光的实时测量GloMax®发现标仪。
细胞表面受体的内化
在配体结合后，细胞表面受体作为信号调节机制经常发生内化。利用CRISPR/Cas9基因编辑将生物发光标签插入受体的细胞外末端，可以监测其内化和随后的转运回细胞表面。
复合治疗后内源性膜受体内化的定量。先前经过crispr编辑以在内源性EGFR位点插入HiBiT的HeLa细胞池被指示用EGF处理。的纳米glo®HiBiT细胞外检测系统用于特异性检测细胞表面表达的HiBiT-EGFR。
下游靶基因调控
信号通路上游蛋白质的丰度或活性的变化往往导致下游靶基因表达的调节。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对内源性下游靶基因进行标记，并检测其对应蛋白的表达，了解其对靶基因调控的影响。使用活细胞测定法，可以实时监测大量下游靶标。
监测上游调控蛋白降解后的cMyc水平。使用CRISPR/Cas9编辑急性髓系白血病模型MV-4-11细胞，在内源性cMyc位点插入HiBiT并共同表达LgBiT。细胞内cMyc基因表达水平受BET蛋白正调控，在失去抑制或BET家族蛋白后应下调。用BET蛋白降解物dBET1和MZ1处理后，实时监测cMyc水平。BET蛋白水平的降低导致下游cMyc靶蛋白的表达减少。
如何执行CRISPR敲入
CRISPR敲入过程是一种简单有效的HiBiT标记方法，不需要分子克隆步骤。从基因编辑到内源性生物学分析，整个过程可以在24小时内完成。
开始
为支持crispr的内源性生物学实验选择工作流程将取决于实验类型、实验室资源和经验以及项目时间表。乐鱼体育是什么您可以从头到尾自己设计您的实验，或者您可以与Promega合作，利用我们的crispr编辑细胞系池和克隆，可用于各种目标蛋白和细胞背景。如果您需要的目标或细胞系目前没有，我们的定制开发团队将很乐意帮助您。
CRISPR基因编辑的更多应用
CRISPR敲入过程的多功能性和便捷性使其能够在广泛的应用中使用。这里给出了一些关键的例子。
GloMax®Discover Microplate Reader
GloMax®Discover是一种即用的多模平板读取器，与Promega试剂化学一起开发，提供了一种简单的检测发光、荧光和吸光度的方法。该仪器可以集成到一个高通量的工作流程中，用于所有内源性生物学实验的CRISPR-HiBiT敲入细胞系。
