药物发现的GPCR研究

G蛋白偶联受体(GPCRs)是一类最重要的药物靶点。了解如何使用易于使用的基于生物荧光的测定方法测量GPCR信号级联的每个步骤的响应。

案例研究:诺丁汉大学医学院

一种新的方法，使用NanoBRET™和NanoLuc®技术，研究药物对识别和反应神经递质的GPCR的影响。

GPCR信号通路综述

基于荧光素酶的检测提供了方便、敏感的方法来测量多种信号通路的GPCR活性。

配体结合

基于NanoLuc®的生物发光共振能量转移(NanoBRET)的高灵敏度使研究活细胞模型中GPCRs及其配体之间的相互作用的方法变得方便。阅读关于此方法的开发 自然方法 出版．

论文:一种用于分析GPCR配体接合的NanoBRET示踪剂的综合方法

论文:发光HiBiT肽可以选择性定量G蛋白偶联受体配体在活细胞中的接合和内化

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GPCR的交互

活化的GPCRs与细胞内蛋白(如G蛋白、GPCR激酶和β-arrestins)的相互作用是G蛋白信号转导的关键步骤，使这些研究成为药物发现的关键领域。灵敏的生物发光分析能够测量活细胞中的这些相互作用，以高通量兼容格式评估实时动力学。

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GPCR内化

配体激活的GPCRs内化是调控受体信号转导的重要步骤。HiBiT标记系统使得为受体内化和随后的循环开发简单的定量分析成为可能，这节省了时间并消除了与基于抗体的方法相关的可变性。

HiBiT-Tagged GPCR内化

对活细胞进行实时动力学分析，
不需要固定，清洗或抗体
同一细胞的总受体测量
与内源性标记受体兼容，用于测量原生生物

用Nano-Glo®HiBiT细胞外检测系统监测异丙肾上腺素依赖的内化。利用CRISPR基因编辑技术将HiBiT标签导入HEK293细胞β2-AR基因中。

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转录反应

GPCR信号级联导致特定转录因子的激活，导致基因表达的改变。响应元件荧光素酶报告载体允许使用简单、灵敏的添加-混合-读取法测定特定GPCR激活转录因子的活性。

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营化验

使用敏感和易于使用的cAMP- glo™和GloSensor™cAMP测定法监测测试化合物对GPCRs影响的cAMP生产。

cAMP-Glo™试验

高灵敏度(30 fmol±5 SEM cAMP/well)和重复性(Z´>0.8)
用单管或高通量平板法测量细胞内cAMP浓度
与粘附，悬浮液，冷冻细胞和组织提取物兼容
生物发光法，较荧光法不易受到化合物干扰
延长了发光信号的半衰期(>4小时)，允许批量处理多个板

cAMP在细胞中的产生和cAMP- glo™Max检测示意图．细胞外配体与其受体的结合改变了相关的异三聚体G蛋白的构象，导致Gα和Gβγ亚基的解离，并启动细胞事件的级联。α亚基被分为几个组:αs， αi/o， αq和α12/13。Gαs激活腺苷酸环化酶，Gαi/o抑制腺苷酸环化酶活性。cAMP-Glo™Max检测在阴影框中描述。随着cAMP浓度的增加，cAMP与蛋白激酶A结合，调控亚基发生构象变化，释放催化亚基。然后，自由催化亚基催化ATP的末端磷酸转移到蛋白激酶a底物上，在这个过程中消耗ATP。剩余ATP的水平是用荧光素酶基激酶glo®试剂测定的。发光与cAMP水平成反比。因此，随着cAMP浓度的增加，发光减弱。

悬液细胞系HEK293滴定福斯科林。在一个白色，透明底部，384孔板，2000 HEK293细胞暴露于指示浓度的forskolin。按照技术手册中的描述进行cAMP-Glo™Max检测。每个点代表8个数据点;误差条表示标准差。数据分析采用GraphPad Prism®软件，采用s型剂量-反应(变斜率)方程。

测定D1受体表达HEK293细胞中SCH23390的IC50值。细胞在诱导缓冲液中重新悬浮，在白色固体384孔板的每孔中添加2000个细胞。在100nM激动剂SKF38393存在的情况下，用指示剂量的SCH23390拮抗剂处理细胞。阴性对照反应中，用alprenolol代替SCH23390。按照技术手册中的描述进行cAMP-Glo™Max检测。数据分析采用GraphPad Prism®软件，采用s型剂量-反应(变斜率)方程。