PARP和DDR通路药物发现
DNA损伤反应(DDR)是一种正常的细胞功能，可导致DNA修复、细胞周期阻滞、衰老和/或细胞凋亡，以响应细胞DNA损伤。DDR通路缺陷导致基因组不稳定，癌症起始和不受控制的细胞增殖。DDR通路中的许多激酶如WEE1、DNA PK和ATM/ATR已被作为癌症治疗的药物靶点。17个成员的多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)蛋白质家族介导了许多细胞过程，包括基因转录和DNA修复，并广泛涉及人类疾病。
Promega提供多种分析和技术，以促进PARP/DDR途径药物的发现。这些包括靶点接合测定，以测量化合物与通路组分的结合，PARP和激酶活性测定和细胞健康测定。
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许多信令网络都与DDR机制相关联。这些模式包括传感器(如PARPs)、介质(如DNA PK、ATM、ATR)以及信号转导器和效应器(如激酶)。PARP蛋白质家族根据多ADP和单ADP核糖化分为两组。
PARP目标业务
NanoBRET™技术提供了一种敏感的，特异性的方法来测量小分子药物与其靶蛋白在活细胞中的相互作用。
使用NanoBRET™目标参与检测，您可以:
- 定量活细胞中化合物的亲和力(它与蛋白质结合的紧密程度)和目标蛋白质占用率(有多少化合物与蛋白质结合)。
- 评估在生理条件下化合物与目标蛋白结合的时间(其停留时间)。
- 缩放简单，多孔检测，以满足您的研究吞吐量的需要。
- 生成低错误率和高可重复性的高质量数据。
- 快速开始可用的现成的分析。
NanoBRET™靶点接合试验原理测试化合物的结合导致完整细胞内靶- nanoluc融合蛋白和可穿透细胞的荧光NanoBRET™示踪剂之间的NanoBRET™信号丢失。
测定活细胞中PARP靶接合度
的NanoBRET™TE PARP分析可用于表征PARP抑制剂对多种PARP的选择性和亲和力。细胞内停留时间可以用一种简单的格式进行评估，即在添加示踪剂之前添加未修饰的化合物。在化合物洗脱后，加入示踪剂并量化在活细胞中的停留时间。
PARP1抑制剂与较少研究的PARPs混杂。
fda批准的临床PARP抑制剂在细胞中参与单PARP谱。
使用NAD/NADH-Glo™检测PARP活性
当DNA受损时，PARP活性上调。单体NAD(+)被消耗，并在损伤部位酶聚合成聚ADP核糖基化链或添加到目标底物上的单ADP核糖。
的发光NAD / NADH-Glo™试验是一种均相检测方法，可检测NAD(+)和NADH，并确定它们在生物样品(如细胞裂解液)中的比例。简单的添加和读取格式可以很容易地适应高通量屏幕。修改后的方案可根据要求测量PARPs和其他酶的活性。
PARP活性测定。在384孔板中检测含有PARP1、375ng核小体和20μM NAD的反应中PARP1的活性。孵育1小时后，加入等体积的改良NAD/NADH Glo™检测试剂，分析NAD水平。20min后记录发光。板一个: PARP1酶的滴定(5μl体积)。面板B: PARP1抑制。
AMP-Glo™检测PARP活性
的AMP-Glo™试验是一种均相测定法，可从产生AMP的任何生化反应中产生发光信号。它可用于测量广泛范围的酶的活性，如环AMP特异性磷酸二酯酶、氨酰基tRNA合成酶、DNA连接酶和泛素连接酶或由AMP调节的酶。
阅读一篇使用该方法监测Poly ADP核糖化的出版物:Mondal, S.， Hsiao, K.和Goueli, S.A. (2017)单磷酸腺苷检测系统在多种酶反应活性监测中的应用。分析和药物开发技术“，15, 300 - 341。
使用改良的AMP-Glo™检测adpribo基化。面板:核小体上PARP1的多聚ADP核基化。用50μg/ml核小体和20μM nad++检测含有PARP1活性的反应，用AMP-Glo™体系分析不同浓度的PARP1。面板B:DPQ检测PARP1抑制作用。
DDR中的激酶
使用ADP-Glo™Assay进行激酶选择性分析
的ADP-Glo™激酶检测是一种适用于所有类型激酶研究的通用体外生化检测方法。该方法测定由激酶反应形成的ADP。ADP被转换成ATP, ATP被用来产生稳定的发光信号。
ADP-Glo检测的应用包括:
- 高通量筛选
- 行动模式研究
- 激酶抑制剂分析
激酶酶系统，经过优化的ADP-Glo™检测，允许您轻松筛选和分析激酶抑制剂。以下是与DNA损伤反应相关的激酶:
- dna - pk
- CHK1
- 相关的
- CDK2 /细胞周期蛋白A1
- CDK2 /细胞周期素E1
- CDK6 /细胞周期素D3
- PLK-family
- CK2α亚型
- MAPKAPK2 (MK2型)
- MARK3
活细胞目标参与
的NanoBRET™靶点接合(TE)激酶测定允许您定量化合物结合到活细胞内全长激酶。检测方法可用于>340个激酶，每个激酶有单独的应用说明，包括许多参与DDR的激酶(例如，CHK1, CHK2, CDK2/Cyclin A1, CDK2/Cyclin E1, CDK6/Cyclin D, PKMYT1, PLK家族，CK2 α亚型，MAPKAPK2 (MK2)， MARK3, Wee1)。每个激酶都有单独的应用说明。查看激酶靶点接合试验选择指南获得可用激酶的完整列表。
与游离细胞分析相比，活细胞中DDR激酶抑制剂的选择性。
检测总或磷酸化的细胞目标
使用Lumit™免疫分析细胞系统研究DNA损伤反应中的信号节点
的Lumit™免疫分析细胞系统是一种无需清洗的生物荧光免疫分析法，可直接测量细胞裂解物中的目标分析物。该检测方法可以定制，使用简单的工作流程检测涉及DNA损伤反应的信号节点，不需要介质移除或裂解物转移。只需将标记的抗体添加到样品中，添加检测试剂并读取发光信号——所有这些都在一个板中。
细胞活力测定
测量细胞活力和细胞毒性
我们提供广泛的分析组合测量细胞活力。这些自动化友好，实时和端点分析允许简单，添加混合读取格式，是二次筛选和先导优化的理想选择。测量候选药物对活细胞(包括3D培养细胞)的细胞健康和细胞毒性的影响。
的CellTiter Glo®2.0细胞活力检测是一种具有宽线性的高灵敏度测定方法。它可扩展到384孔和1536孔板，用于高通量的初级筛选应用。
请参阅这些出版物中如何将这些细胞健康分析应用于DDR。
选择参考:
- 齐默尔曼等人(2022)指导ATR和PARP抑制剂联合化学基因组筛选．细胞的报道．40, 111081年。
- Kim, C. et al. (2020)PARP1抑制剂通过PARP1诱捕诱导的DNA损伤反应触发先天免疫．eLife8月26日，e60637。
- 祝福，C.等人(2020)致癌解旋酶ALC1通过在DNA断裂处捕获PARP2来调节PARP抑制剂的效力．摩尔。细胞。80, 862 - 875。
分析服务
我们的定制检测服务可以帮助加快您的小分子和大分子药物的发现和开发工作流程。这些全面的服务是建立在我们的技术敏感，高通量和生物相关的结果。欲了解更多信息，联系定制研发解决方案团队．
PARP化合物选择性分析服务
- 使用NanoBRET™TE分析活细胞对12个PARP家族成员的选择性分析
- 比率BRET数据具有低错误率的可重复性
激酶细胞选择性化合物分析服务
- 使用NanoBRET™TE检测240种激酶对活细胞进行选择性分析
- 比率BRET数据具有低错误率的可重复性