开发蛋白质降解物时要考虑的关键问题
Promega提供了一系列基于细胞的分析方法，用于开发有效的蛋白质降解物。这些产品用于leyu乐鱼网回答以下关键问题:
目标降级了吗?
HiBiT技术可以定量分析蛋白质降解物的功能。HiBiT是一个11个氨基酸的肽标签，对其互补伙伴LgBiT具有很高的亲和力。它们共同组成了二元发光蛋白NanoBiT®萤光素酶。在HiBiT- lgbit结合后，当使用CRISPR基因编辑将HiBiT引入内源性位点时，活性荧光素酶蛋白产生一个非常明亮和高灵敏度的读数，与内源性靶蛋白水平相关。
加入引起降解的化合物会导致发光信号的损失，这是高度定量的，可以实时测量。细胞剂量-响应曲线可以在24- 48小时内获得和监测，允许准确测定降解率，Dmax, DC50值和蛋白质回收率。
这种方法允许针对一系列不同参数的降解快速排序，并且该方法适用于高通量筛选。
HiBiT融合的图解:细胞内的LgBiT互补。
PROTAC处理后内源性HiBiT-BRD4的降解动力学。HiBiT插入内源性BRD4位点HEK293 LgBiT细胞系．细胞用MZ1滴定处理在二氧化碳无关的培养基含有Nano-Glo®Endurazine™衬底．一个:动能发光;B:降解率;C:距离。
利用CRISPR敲入细胞系和克隆体实时研究蛋白质降解。
读了白皮书．
什么是PROTAC的细胞渗透率和靶亲和性?
在开发降解化合物时，重要的是评估它们的细胞通透性和对靶蛋白和E3连接酶的亲和力。的NanoBRET™目标参与(TE)分析能够测量活细胞中蛋白质-小分子结合的相互作用，定量测定化合物的亲和力和目标蛋白的占用率。
NanoBRET™TE检测利用来自NanoLuc®荧光素酶标记靶蛋白的生物发光共振能量转移(BRET)和可渗透细胞的荧光NanoBRET™示踪剂。当示踪剂可逆地与细胞中的靶-NanoLuc融合蛋白结合时，通过发光能量从NanoLuc标记的靶蛋白转移到可渗透细胞的荧光示踪剂，实现BRET。通过与NanoBRET™示踪剂的竞争来衡量靶点接合度，这将导致BRET的损失。测量产生了化合物的细胞亲和力，可以使用添加，可扩展的多孔板法进行。
我们已经成功地使用NanoBRET™TE技术开发了多种药物发现中重要的靶标类的分析方法，包括激酶、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和溴化域。最近，该技术已被应用于E3连接酶，并开发了CRBN、VHL、XIAP、cIAP和MDM2的NanoBRET™TE测定方法。NanoBRET™TE E3连接酶分析可以在活细胞或渗透细胞中进行，这允许用户评估E3连接酶的化合物亲和力以及化合物的渗透性。了解更多关于NanoBRET™TE E3连接酶检测的信息海报．
停留时间是SAR研究中监测的一个重要参数，可提高降解效能。NanoBRET™TE分析可以在动力学模式下配置，以了解化合物在目标蛋白质中的停留时间。
工具也可用于构建用于额外E3连接酶和其他靶标的NanoBRET™TE分析。看到设计你自己的目标参与试验．
NanoBRET™靶靶接触试验原理
使用NanoBRET™TE分析法测量靶向BRD4的BET降解物的细胞亲和力．使用BRD4 NanoBRET™TE检测比较两种靶向BRD4的相关PROTACs的细胞结合亲和力(左图)。使用NanoBRET™TE CRBN测定法在活细胞和透性细胞中比较E3连接酶CRBN降解剂的亲和力，以评估化合物的渗透性对所测结合亲和力的贡献(右图)。研究表明，dBET6比dBET1更具有渗透性，dBET6对CRBN的亲和力略高于dBET1。
我的PROTAC是否形成三元络合物?
E3三元配合物(包含目标物、降解物和E3连接酶)的形成是靶向蛋白降解的关键步骤。这一步是开发和优化有效降解化合物的关键参数。NanoBRET™技术非常适合在活细胞格式中研究三元络合物的形成，允许端点或动力学分析。
在本实验中，目标蛋白作为能量供体(生物发光)，在细胞中表达为外源性瞬时NanoLuc®融合或在表达lgbit的细胞中内源性标记HiBiT融合。HaloTag®融合物与von Hippel-Lindau (VHL)或cereblon (CRBN) E3连接酶组件外源表达，并用荧光配体标记作为能量受体。
NanoBRET三元配合物形成示意图。
利用活细胞端点检测复用protac诱导BRD4 VHL/CRBN三元复合体的形成和BRD4蛋白水平。用1:100比例的NanoLuc®-BRD4供体质粒与HaloTag®-VHL或HaloTag®-CRBN受体质粒转染细胞(BRD4/VHL法)，用MG132(或DMSO对照)预处理，随后用1µM MZ1(基于VHL的PROTAC)或DMSO处理。NanoBRET™比值表明三元配合物形成(板一个)和NanoLuc®发光指示目标蛋白水平(面板B)由PROTAC处理引起。
PROTAC处理后BRD4/VHL三元配合物形成的动力学监测．HiBiT插入内源性BRD4位点HEK293 LgBiT细胞系使用CRISPR/Cas9基因编辑。用HaloTag®-VHL受体质粒转染一个稳定克隆。PROTAC处理前用MG132预处理细胞。NanoBRET™信号测量使用NanoBRET™纳米glo®动力学检测系统实时监测三元配合物形成情况。
从VHL和CRBN的三元复合研究开始。
视图起动器套件
我的目标变得无处不在了吗?
NanoBRET™技术可用于测量靶蛋白泛素化动力学，或以端点格式用于测量复合剂量-反应曲线等应用。
在NanoBRET™泛素化试验中，目标蛋白作为能量供体，在细胞中作为外源性瞬时NanoLuc®融合表达，或在表达lgbit的细胞中作为内源性标记HiBiT融合表达。haltag - ub融合是作为能量受体外源表达的。活细胞NanoBRET™检测通过端点分析或动力学分析实时进行。与三元络合物的形成类似，泛素化的变化通常在化合物添加后1-4小时内观察到。
纳米bret -泛素复合体的示意图。
BRD4泛素化的动力学监测。HiBiT插入内源性BRD4位点HEK293 LgBiT细胞系使用CRISPR/Cas9基因编辑。用HaloTag®-泛素受体质粒转染一个稳定克隆。细胞经1μM MZ1或1μM dBET1处理后，细胞内细胞的活性明显增强NanoBRET™纳米glo®动力学检测试剂用来测量目标蛋白的泛素化随时间的变化。
PROTAC治疗后BRD4泛素化，使用活细胞终点试验。HEK293细胞转染nanouc®-BRD4和HaloTag®-Ubiquitin质粒，供体∶受体比例为1:10，镀上HaloTag®NanoBRET™618配体，用10μM dBET1或MZ1 PROTAC化合物连续稀释1小时。对于这两种PROTACs，我们观察到BRET比值的剂量依赖性增加。误差条表示标准差，n = 3。
基于抗体的PROTAC®活性检测。采用1 μM dBET1或MZ1 PROTACs在指定时间内处理含有内源性标记HiBiT-BET家族成员并表达LgBiT的HEK293细胞。用地地黄苷溶解细胞，并与初级多克隆抗泛素和Alexa-594荧光二抗孵育10分钟，以确定NanoBRET™比率。通过归一化到t = 0时间点，数据表示为NanoBRET™值的翻倍增长。n = 3次实验的变异性用SEM表示。
联系我们为了了解更多关于研究靶点泛素化的抗体方法，
或者从NanoBRET™泛素化入门套件．
靶细胞降解的表型后果是什么?
细胞内蛋白质的暂时性降解通常会引起与基因敲除或蛋白质突变截然不同的表型。HaloPROTAC3是HaloTag®标签和PROTAC的融合，是一种快速、高效的理解和表征蛋白质降解表型的方法。
HaloPROTAC3将内源性的VHL E3连接酶组件引入到HaloTag®融合蛋白中，通过蛋白酶体途径导致泛素化和降解。HaloPROTAC含有诱导降解的酰基胺部分，通过可变长度的连接剂连接到氯烷烃部分。
为了研究相关细胞背景下的内源性蛋白损失，我们建议通过CRISPR/Cas9基因编辑将HaloTag®或HiBiT-HaloTag®标签合并到目标蛋白位点。在使用HaloPROTAC-3处理的细胞中，使用HaloTag®单克隆抗体(针对HaloTag®标记)或活细胞发光(针对HiBiT-HaloTag®标记)监测蛋白质损失。HaloPROTAC3与内源性标记的HaloTag®融合蛋白在长时间内保持快速爆发损失。
HaloPROTAC函数的概述。
的HiBiT-BRD4 degradogram．BRD4，内源性标记HiBiT和HaloTag®标签，使用增加的HaloPROTAC浓度降解，并使用HiBiT发光量化。
HaloPROTAC3与2020年Cell论文中的dTag技术进行了比较蛋白质水解-靶向嵌合体作为生物发现的治疗方法和工具(https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.031)。本文介绍了蛋白质水解靶向嵌合体(prote水解-targeting chimeras, PROTACs)，它能够利用泛素-蛋白酶体系统在翻译后水平调节蛋白质浓度。HaloPROTAC3还与其他技术如RNAi和基因组编辑的protac介导的蛋白质水平调节进行了比较。
HaloPROTAC3也被用于在体内(小鼠)降解肝脏中的PNPLA3水平。详情请参阅出版物:PNPLA3在脂滴上的积累是相关肝脂肪变性的基础．
准备好开始用HaloPROTAC3进行降解试验了吗?
视图HaloPROTAC配体
Promega提供什么降级分析服务?
- 单浓度或DRC测定DC50
- 细胞活力建议在后期时间点
用泛激酶PROTAC TL-12-186处理HEK293 CRISPR HiBiT CDK家族成员，通过监测指定时间点的发光损失来确定其降解的相对水平(左面板)．另外，用Cell- titer®Glo监测细胞活力，并绘制相对降解曲线(右面板)．
动力学降解复合剖面
- 建议时间范围为0-24小时
- 单浓度或DRC测定Dmax50
- 提供降级率、Dmax、Dmax50和恢复信息
用Iberdomide和活细胞的DRC处理CRISPR IKZF1-HiBiT Jurkat细胞，在GloMax®Discover上监测动力学降解。IKZF1的动力学降解还使用了其他几种分子胶，从这些图谱中，降解率(左面板)及Dmax (右面板)是在整个刚果民主共和国测定的。对每种化合物的比较反应被绘制为降解速率和Dmax。
NanoBRET™目标订婚
- 对>200激酶蛋白的选择性分析和复合剂量-反应随访
- E3连接酶复合物分析(CRBN, VHL, XIAP, cIAP1, MDM2)
在表达CRBN或VHL E3连接酶组分的NanoLuc®融合的HEK293活细胞中进行靶向接合竞争性置换实验。CRBN分析显示分子胶化合物和CRBN基的PROTACs (左面板)，而VHL试验显示了VHL粘合剂和基于VHL的PROTACs的位移(右面板)．
NanoBRET™三元配合物形成
- 确定复合联想率和效价
用haltag - crbn转染表达LgBiT的CRISPR HiBiT-BRD2 HEK293细胞，用指示浓度的dBET1 (左面板)或dBET6 (右面板)和MG132。进行了动力学活细胞NanoBRET™实验，反映了在指定的时间框架内诱导BRD2:dBET:CRBN三元络合物的形成。
NanoBRET™目标泛素化
- 测定泛素化率和效价
用haltag - ub转染表达LgBiT的CRISPR HiBiT-BRD2 HEK293细胞，用指示浓度的dBET1 (左面板)或dBET6 (右面板)．进行了动力学活细胞NanoBRET™实验，反映了在指定的时间框架内BRD2的诱导泛素化。
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