RAS途径药物发现
RAS是人类癌症中最频繁突变的致癌基因，KRAS是RAS家族中最频繁突变的亚型。大多数肺癌、胰腺癌和结直肠癌都是由KRAS突变引起的。在最近发现KRAS (G12C)特异性共价抑制剂之前，KRAS一直被认为是一种不可服用的靶点。
Promega提供多种分析和技术，以促进RAS药物的发现。这些测试测量化合物与途径成分的结合，并评估它们对蛋白质的影响:蛋白质相互作用，蛋白质水平，最终，ERK的激活。
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NanoBRET™靶靶接触试验原理。
ERK2靶接合试验。用ERK2融合蛋白滴定所指示的化合物，以测定其在活细胞中的占用率。
激酶靶结合试验的完整列表，包括RAF, MEK和ERK，见我们的选择表．
新的PAN RAS靶接触试验
我们开发了一种泛kras NanoBRET™示踪剂，该示踪剂能够检测这个具有挑战性的靶点上的各种正构和变构接触机制，以前被认为是“不可耐药的”。
一个。
B。
Pan-KRAS NanoBRET™靶靶接触试验。集成电路50测定活细胞中测试化合物的值(板一个)及细胞裂解物(面板B）.
了解更多关于我们的RAS NanoBRET™TE分析
在特定PPIs条件量化TE
联系我们关于BRAF, CRAF或ARAF的原聚物特异性分析
阅读更多关于KRAS的目标参与
本文，发表于化学生物学性质，我们研究了KRAS小分子抑制剂的可逆结合，以评估哪些热点突变体易受细胞中开关- ii口袋(SII-P)接合的影响。我们发现许多KRAS热点突变体的SII-Ps可以通过非共价配体获得。我们的结果强调SII-P是KRAS上的一个特殊药物结合位点，揭示了ras驱动癌症的新的治疗机会。
HiBiT:用于研究细胞内蛋白质降解的LgBiT互补。
延时live-cell成像。用BET溴化域降解剂MZ1处理CRISPR-HiBiT BRD4细胞。观察到BRD4均匀损失超过2小时。使用奥林巴斯LV200系统进行成像。
利用HiBiT降解蛋白质
HiBiT是研究内源性疾病的常用标签蛋白质的降解．HiBiT是一种含有11个氨基酸的小肽，它与一种更大的亚基LgBiT具有高度亲和力。结合物具有较高的荧光素酶活性，并在添加的底物存在时产生明亮的发光信号。与较大的标签相比，HiBiT标签的小尺寸允许更高的敲入效率，不需要分子克隆步骤，使其非常适合CRISPR/Cas9编辑工作流程。
加入引起降解的化合物会导致发光信号的损失，这是高度定量的，可以实时测量。细胞剂量-响应曲线可以在24- 48小时内获得和监测，允许精确测定降解率D马克斯特区50价值和蛋白质恢复。这种方法允许针对一系列不同参数的降解快速排序，并且该方法适用于高通量筛选。
一个。
B。
PROTAC处理后内源性HiBiT-KRasG12C活细胞降解动力学面板。HiBiT通过CRISPR/Cas9插入MIA-PaCa2细胞系内源性KRasG12C基因座n端。在表达LgBiT后，使用基于vhl的KRasG12C PROTAC, LC-2在CO中进行剂量反应动力学降解实验2独立中包含Nano-Glo®Endurazine™衬底．分数RLU是相对于DMSO对照绘制的。面板B。在MIA-Paca2细胞中使用母抑制剂MRTX849对HiBiT-KRasG12C进行了类似的活细胞发光研究，在相同的剂量反应处理中，没有显示KRasG12C的损失。
有关现成的CRISPR敲入报告细胞系的完整列表，包括WT和几种KRAS、B-RAF和NRAS的突变体，请参阅我们的当前细胞系列表．
活细胞和生化蛋白:蛋白质相互作用
NanoBRET™技术
NanoBRET™技术能够在自然细胞环境中对蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)进行敏感、可复制的检测。使用低水平表达的全长蛋白使PPI监测和筛选研究能够反映真实的细胞生理学。与传统的BRET分析相比，明亮的、蓝移的供体信号和红移的受体创造了最佳的光谱重叠、增加的信号和较低的背景。
NanoBRET™PPI检测原理。
您可以阅读更多关于NanoBRET™技术的功能，并在本出版物中查看示例数据:
Machleidt, T。et al。(2015)纳米BRET -一种用于分析蛋白质相互作用的新型BRET平台．ACS化学。医学杂志。10(8), 1797 - 1804。
一个。
B。
NanoBRET™横跨RAS和RAF家族成员，用于研究通路中蛋白质相互作用的抑制和/或诱导。动力学RAS:RAF测定+/ - BI-2852抑制剂(板一个）;RAF二聚分析显示GDC0879 (面板B）.
一个。
B。
抑制KRAS WT:SOS1cat结构域相互作用．通过BI-3406和BAY-293的剂量响应处理，SOS1的催化结构域与KRAS WT分离。
NanoLuc®二元技术(NanoBiT)是一种基于NanoLuc®荧光素酶的双亚基系统，可应用于PPIs的细胞内检测在活细胞。这段短视频解释了这项技术是如何工作的。
NanoBiT®PPI检测原理。
为了了解更多关于使用NanoBiT®技术研究RAS通路中涉及的PPIs的信息，下载此幻灯片显示了野生型和突变KRAS与CRAF或BRAF配对的数据。
在本文中阅读关于NanoBiT®技术的起源:et al。(2016)。NanoLuc互补报告器用于精确测量细胞内蛋白质相互作用．ACS化学生物学。p . 400 - 408
NanoBiT®检测KRAS 4B野生型和突变体与RAF亚型的相互作用。带有CRAF RBD域的KRAS 4B (板一个）;KRAS 4B与全长CRAF (面板B）;KRAS 4B全长BRAF (面板C）.
实时监测KRAS 4B (WT): EGF处理后血清饥饿HeLa细胞中的crf(全长)相互作用。
我们有各种NanoLuc®，HaloTag®，NanoBiT®和BiBRET载体，以帮助您开始您的PPI分析。联系我们为更多的信息。
检测标记蛋白的PPI
在Lumit™PPI免疫测定， streptavidin和抗常见标签的抗体用LgBiT和SmBiT标记。当两个不同标记的蛋白质结合时，可以使用相应的SmBiT-和lgbit -偶联抗体检测相互作用。
KRAS(G12C)/RBD-cRAF与AMG510的相互作用
Lumit™KRAS- craf试验可用于检测KRAS突变体小分子抑制剂的特异性。
KRAS(G12C)/RBD-cRAF相互作用动力学
KRAS激活周期可以被重构在体外在小分子抑制剂存在的情况下，可以监测KRAS/cRAF结合的动力学，作为sos1介导的GDP/GTP交换的反映。
Lumit™Phospho-ERK免疫测定
的Lumit™免疫分析细胞系统是一种免洗生物发光免疫分析法，直接测量细胞裂解物中的目标分析物。无需去除培养基或裂解物转移，只需将标记抗体添加到样品中，添加检测试剂并读取发光信号，所有这些都在一个平板中!我们定制了这种检测方法来检测磷- erk活性。
Lumit™免疫分析细胞系统的原理。
您可以在本出版物中了解更多关于使用Lumit™p-ERK免疫分析法研究KRAS的信息:
Swiatnicki, M。et al。(2022)用基于细胞的Lumit p-ERK免疫分析法分析KRAS突变药物的致癌性。sla的发现。249 - 247 p。
RAS突变体抑制剂。Lumit™实验显示了单个突变KRAS抑制剂的细胞p-ERK抑制谱。在MCF-7 (WT)、SW620 (G12V突变体)、Mia-PaCa-2 (G12C突变体)、AsPC-1 (G12D突变体)中完成KRAS抑制剂突变体的滴定，并使用Lumit™p-ERK作为代理检测KRAS抑制。面板得了。p-ERK Lumit™实验显示KRAS G12C化合物具有高选择性，对Mia-PaCa-2细胞具有完全抑制作用，对KRAS WT、G12D和G12V细胞无抑制作用。面板D。Lumit™检测显示，MRTX-1133对KRAS G12D具有很强的选择性，在较高的IC50s下对KRAS G12C和G12V有一定的混杂性。
GTPase-Glo™试验
的GTPase-Glo™试验分析了GTPase、GAP刺激的GTPase、GAP和GEF的内在活性。该方法测量GTP酶反应后剩余的GTP酶转化为ATP，然后对生成的ATP进行生物荧光检测。