自噬检测

自噬是一种细胞内降解过程，涉及许多生理和病理条件。当自噬被诱导时，形成一个隔离膜，它包围了部分细胞质并形成双膜囊泡(自噬体)。自噬体外膜与溶酶体融合形成自噬小体，将吞噬的细胞器成分与自噬体内膜一起降解。“自噬通量”指的是自噬的整个动态过程。

哺乳动物LC3B是一种自噬体标记物，经Atg4在其c端处理后生成LC3-I。LC3-I主要是细胞质，但通过磷脂酰乙醇胺(PE)偶联脂化形成LC3-II，定位于自噬体的内外膜。自噬体与溶酶体融合后，内膜结合的LC3-II被溶酶体蛋白酶降解。通过分子量变化监测LC3-I向LC3-II的转化是监测自噬途径变化的常用方法。成像LC3B在细胞中的定位从弥漫性(以胞浆LC3-I的形式)到集中性(LC3-II在自噬小体或点状)是跟踪自噬变化的另一种方法。

有几种方法可以监测自噬体的形成和自噬通量。然而，每种方法都有其局限性，并且应该使用不止一种方法来验证自噬活性。例如，使用GFP-LC3定位确定的自噬体数量是测量自噬活性的常用方法。然而，该结果可能具有误导性，因为自噬的诱导和抑制都可能导致自噬体积累的增加，这取决于摄动发生在通路的哪个位置。

自噬LC3 HiBiT报告分析系统可用于三个检测模块，以明确量化自噬通量。首先，在基于平板阅读器的检测中，通过监测基于lc3的报告蛋白的总水平来测量自噬通量。稳定表达自噬报告细胞和用自噬刺激剂处理的细胞会显示发光信号下降。用自噬抑制剂治疗会导致lc3基报告蛋白水平的升高，从而产生更高的发光信号。其次，LC3报告细胞上的HiBiT标签可以与Nano-Glo®HiBiT Blotting System一起使用，监测LC3- i到LC3- ii的分子量变化。该系统用更快更简单的协议取代了繁琐的西方印迹。最后，报告器的HaloTag®部分可与荧光染料一起使用，以成像LC3在细胞内的位置。使用单个报告器进行基于平板阅读器的定量分析，以及补充成像和印迹分析，允许自噬途径的多功能分析。