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GloSensor™技术

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活细胞生物传感器cAMP, cGMP或蛋白酶活性

  • 生物传感器使受体生物学的分析更加全面
  • 简单,可扩展的检测协议
  • 高Z和大信号:背景比

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GloSensor™技术
分析试剂/ 25毫克
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荧光素酶生物传感器实时检测信号事件

GloSensor™技术提供了一个灵活的荧光素基生物传感器平台,可实时检测活细胞中的信号事件,具有敏感性、线性性和特异性。

GloSensor™荧光素酶是圆形排列的,将野生型N端和c端与多肽或蛋白质结构域连接,并在结构的其他地方创建工程端。分析物结合或蛋白酶裂解导致生物传感器的构象移位,促进发光活性的大幅增加。发光增加的幅度与存在的分析物或蛋白酶活性的量成正比。

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简单,可扩展,活单元协议

GloMax Discover系统多模版读取器

活细胞,非裂解分析协议易于执行,允许生物传感器活性连续监测或在一个时间点。细胞信号事件的动力学剖面可以实时跟踪,分析可以轻松扩展到高密度微板格式,包括96孔、384孔和1536孔板。

协议步骤如下:

  • 用GloSensor™cAMP试剂预平衡细胞约2小时。

  • 用特定的激动剂/拮抗剂或库化合物处理。

  • 连续或在单个时间点测量10-30分钟后的发光。

任何带注射器的光度计都足以读取化验结果。

进行cAMP, cGMP或蛋白酶检测

营分析
cGMP化验
蛋白酶试验

在活细胞试验中监测细胞内cAMP

GloSensor™cAMP检测可用于监测内源性或过表达的g -或gi偶联的7-TM, g蛋白偶联受体(GPCRs)的激活,以及负责降解细胞内cAMP的磷酸二酯酶(PDEs)。细胞内cAMP浓度的变化可以使用活细胞非溶性检测格式进行跟踪,从而实现对cAMP浓度变化的实时监测。

GloSensor™cAMP检测中可使用不同的生物传感器。在每种情况下,一个cAMP结合域被融合到一个圆形排列形式的萤火虫荧光素酶上。每一种的序列都不同,这使得生物传感器对cAMP具有一系列的亲和性。一般来说,pGloSensor™-22F cAMP质粒最适合于大多数应用,提供了独特的灵敏度和动态范围的组合。22F结构足够敏感,可以在没有添加forskolin的情况下监测反向激动剂活性或gi偶联受体激活,但具有足够大的动态范围来监测细胞内cAMP浓度的大幅增加。

订购额外的cAMP载体和细胞株
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与cAMP免疫分析法相比,GloSensor™cAMP的动力学反应。瞬时表达pGloSensor™-22F cAMP质粒的HEK293细胞分别用1µM异丙孕烯醇(ISO)、10µM普萘洛尔(PRO)和10µM福斯柯林(FSK)处理。活细胞非溶解GloSensor™cAMP检测方案用于监测cAMP水平,而在每个时间点都裂解重复孔进行cAMP免疫分析(Enzo Life Sciences)。约20nM以上的样品需要稀释,使cAMP免疫分析在标准曲线的线性范围内。(ISO = ADRB2激动剂,PRO = ADRB2拮抗剂,FSK =腺苷酸环化酶细胞透性激活剂)。

在活细胞试验中监测细胞内cGMP

GloSensor™cGMP检测用于监测第二信使cGMP细胞内浓度的变化。该方法可用于监测内源性或过表达的禽酰基环化酶的激活,包括可溶性禽酰基环化酶(sGC)或房利钠肽受体(NPRA和NPRB)异构体,以及负责降解细胞内cGMP的磷酸二酯酶(PDEs)。细胞内cGMP浓度的变化可以使用活细胞、非裂解检测格式进行跟踪,从而实现实时监测cGMP浓度的变化。

GloSensor™cGMP检测中可使用不同的生物传感器。在每种情况下,一个cGMP结合域被融合到一个圆形排列形式的萤火虫荧光素酶上。每种cGMP的结合域和序列不同,使得生物传感器对cGMP具有不同的亲和力。一般来说,过表达鸟酰基环化酶时,40F结构是首选的,在细胞内高水平的cGMP下提供最大的动态范围。相比之下,在测定内源性禽酰基环化酶时,42F结构是首选的,它对细胞内较低水平的cGMP具有最大的敏感性。

cGMP检测
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实时监控cGMP。瞬时表达42F结构的HEK293细胞用不同剂量的硝普钠(SNP)(一氧化氮供体)处理,以激活内源性可溶性鸟酰基环化酶(sGC)。活细胞、非溶性GloSensor™cAMP检测协议用于实时监测cGMP反应。

蛋白酶活性的荧光检测

GloSensor™蛋白酶测定法用于监测蛋白酶活性在体外和体内。该方法利用圆形排列形式的荧光素酶,其中野生型N端和c端与含有蛋白酶裂解位点的肽连接。一旦被相应的蛋白酶裂解,构象约束被解除,导致发光活性大幅增加。使用该技术,包括需要P '残基进行有效裂解的蛋白酶,体外验证了含有长达20个氨基酸的蛋白酶裂解位点的多肽。

一种新的GloSensor™蛋白酶结构,30F质粒,开发用于活细胞,非溶酶活性测定,用于细胞培养和体内模型。当与caspase-3/7切割位点工程时,GloSensor™caspase 3/7生物传感器实现了一种敏感的、实时的方法来检测caspase-3/7活性,从而实现了一种动物模型中细胞凋亡的体内测量方法。GloSensor™caspase 3/7生物传感器,连同用于检测颗粒酶B的类似结构,也被用于检测由体外来源或体外细胞毒性T淋巴细胞(ctl)介导的靶细胞凋亡。你可以在这篇文章中阅读更多关于这项工作的内容:细胞培养和动物模型中caspase-3/7活性的实时测定

GloSensor™caspase 3/7生物传感器质粒,稳定细胞系和颗粒酶生物传感器质粒可作为自定义检测材料。这些生物传感器质粒可以直接使用或通过插入新的裂解位点进行修饰,为特定的蛋白酶创建生物传感器。

蛋白酶测定法

GloSensor™质粒

我们提供两种变体的生物传感器,我们推荐pGloSensor™-22F cAMP质粒作为大多数应用的首选。

pGloSensor™-22F cAMP质粒。体外无细胞表达后,该结构编码的版本显示EC增加50与pGloSensor™-20F cAMP结构编码的版本相比,在cAMP饱和状态下,激活以及增加信背景比。一般来说,当我们在活细胞中比较这两种结构的性能时,我们已经观察到它们之间类似的关系。

pGloSensor™-20F cAMP质粒。这种结构编码的版本在37°C的HEK293细胞中表现良好。pGloSensor™-22F cAMP质粒结构的发光在生理温度下更难以检测。

要了解这两种质粒之间性能差异的详细解释,请参阅第3节。B, GloSensor™质粒选择的建议,见技术手册#TM076(见下面的协议部分)。

pGloSensor-22F cAMP质粒。
pGloSensor™-20F cAMP,注册号EU770615序列(. txt文件)
pGloSensor™-22F cAMP,注册号GU174434序列(. txt文件)

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GloSensor™cAMP试剂

E129A 1 × 25mg

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仅供研究用途。不用于诊断程序。

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有关详细的存储建议,请参见协议。

规范

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GloSensor™cAMP试剂

E129B 1 × 250mg

SDS

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分析证书

按地段编号查册

使用限制

仅供研究用途。不用于诊断程序。

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规范

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pGloSensor™-22F cAMP质粒

E230A 1 × 20μg

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通过使用本产品,研究者同意受此有限使用标签许可条款的约束。如果研究人员不愿意接受本标签许可的条款,且产品是未使用的,Promega将接受未使用的产品的退货,并为研究人员提供全额退款。
研究人员可以在自己的研究中使用本产品,仅用于分子结合、酶活性或其他功能活性的发光测定。研究人员无权修改或以其他方式创建编码本产品GloSensor™技术的核苷酸序列变体(即包含荧光素酶和其他功能域的生物发光嵌合蛋白)。研究人员可以将衍生品转让给他人,前提是接受者同意在转让之前受本标签许可条款的约束。未经Promega事先明确的书面同意,不得擅自使用或转让本产品。此外,研究人员必须:(1)在体外和细胞应用中使用GloSensor™cAMP试剂,在动物应用中使用VivoGlo™荧光素,用于本产品及其衍生物的所有发光活性测定;或(2)联系Promega以获得使用该产品及其衍生品与非从Promega购买的发光检测试剂的许可证。Promega不就产品的适销性或适合某一特定用途作出任何明示或暗示的陈述或保证。本标签许可的条款应受美国威斯康辛州法律管辖。

专利申请中。

美国帕特。8008006号。

美国帕特。第7,728,118号及其他未决专利。

规范

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pGloSensor™-20F cAMP质粒

E117A 1 × 20μg

SDS

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专利申请中。

美国帕特。8008006号。

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