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NanoBRET™泛素化入门套件

基于活细胞bret的蛋白质泛素化测定方法

  • 一般泛素化试验,以测量目标蛋白的泛素化相对水平的变化
  • 执行端点或活细胞动力学分析,以确定蛋白质泛素化动力学
  • 测定异位或内生表达蛋白的泛素化

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NanoBRET™泛素化入门套件
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测定活细胞中靶蛋白的泛素化

调节细胞蛋白质的整体内稳态对维持细胞健康至关重要,细胞治疗或疾病状态往往会改变这种平衡。大多数蛋白质及其丰度都是通过泛素蛋白酶体系统(UPS)调节的,该系统利用泛素偶联来向蛋白质发出信号,将其转运到蛋白酶体进行降解。在任何给定的靶点上的泛素化可以有不同的水平,单泛素化和多泛素化,并通过多种氨基酸连接介导。

NanoBRET™泛素化入门工具包提供了创建目标特异性活细胞泛素分析的工具,可在全球范围内测量目标蛋白质上的所有类型的泛素化。该分析可用于测量在小分子或通路诱导剂等细胞处理后目标蛋白泛素化相对水平的动态增加或减少,这些处理将分别影响蛋白质的稳定或降解。这些分析对于研究靶向降解化合物特别有用,因为NanoBRET™信号的生物发光共振能量转移比意味着您可以研究蛋白质泛素化,同时监测目标蛋白质水平以评估降解。

NanoBRET™试验原理

NanoBRET测定原理

泛素化分析概述

泛素化BRET检测概述

如何开始

  1. 生成泛素化靶的生物发光供体蛋白。供体蛋白可以通过提供的NanoLuc®克隆载体创建为NanoLuc®融合蛋白,也可以通过CRISPR-Cas9基因编辑创建具有HiBiT标记的内源性靶点。在任何可转染的细胞系中瞬时或稳定表达NanoLuc融合。将LgBiT表达载体转染到HiBiT CRISPR细胞系中,在细胞中产生二元互补。的NanoLuc®-BRD4 FL融合载体作为阳性对照。
  2. 介绍HaloTag®泛素通过与NanoLuc®融合蛋白共转染或与LgBiT载体(如果使用HiBiT CRISPR细胞系)共转染瞬时转染融合蛋白。标记的HaloTag®融合蛋白将在BRET试验中作为荧光受体。由HaloTag®控制载体表达的HaloTag®蛋白被用作阴性对照。
  3. 用影响靶蛋白泛素化水平的化合物处理细胞。
  4. 添加NanoBRET™Nano-Glo®试剂,无论是端点试剂还是动力学试剂,为供体蛋白提供底物,为受体蛋白提供荧光NanoBRET™HaloTag®618配体。使用滤过的发光测量供体和受体信号,并确定NanoBRET™比率。

在活细胞实验中测量目标蛋白泛素化的化合物依赖水平

检测降解剂复合处理后蛋白泛素化动力学

靶向降解化合物,如PROTACs和分子胶水,在蛋白质和E3连接酶组分之间创建三元复合体。一个高产且活性的三元络合物将导致目标蛋白泛素化和随后通过UPS降解的增加。在这里,我们展示了一种内源性标记蛋白HiBiT-BRD4,其泛素化水平的动态增长依赖于特定的PROTAC处理。

内源性BRD4泛素化动力学
监测信号通路调制后泛素化和多重靶蛋白水平的变化

在Wnt信号缺失的情况下,β-catenin被磷酸化和降解,产生高水平的泛素化β-catenin。在这里,我们使用内源性hibit标记的β-catenin和瞬时转染的HaloTag®-泛素融合和LgBiT载体来证明,通过化合物AZD2858抑制上游激酶GSK-3β的泛素化和随后的蛋白质稳定降低。由于β-catenin是NanoBRET™试验中的供体蛋白,因此在同一试验中对其蛋白水平进行单独监测。因此,你可以确定相对丰度的目标蛋白和泛素化在一个单一的试验。

监测信号通路调制后泛素化和多重靶蛋白水平的变化

规范

盒子里是什么?

部分# 大小 浓度 可单独购买

HaloTag®控制向量

G659A 1×20μg

HaloTag®NanoBRET™618配体

G980A 1×20μl 查看产品

pNLF1-N[巨细胞病毒/ Hygro]向量

N135A 1×20μg 1μg /μl

pNLF1-C[巨细胞病毒/ Hygro]向量

N136A 1×20μg 1μg /μl

NanoBRET™Nano-Glo®衬底

N157A 1×50μl 查看产品

NanoLuc®-BRD4 FL融合载体

N169A 1×20μg

HaloTag®泛素融合向量

N272A 1×20μg 1μg /μl

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使用限制

仅供研究用途。不用于诊断程序。

专利和免责声明

通过使用本产品,研究者同意受此有限使用标签许可条款的约束。如果研究人员不愿意接受本标签许可的条款,且产品是未使用的,Promega将接受未使用的产品的退货,并为研究人员提供全额退款。

研究人员只能将本产品用于研究用途;请勿作商业用途。商业使用是指一方为换取对价而对本产品的任何和所有使用,包括但不限于(1)用于进一步的产品制造;(2)在提供服务、信息或数据时使用;以及(3)产品的转售,无论该产品是否转售用于研究。研究者无权修改或以其他方式创造产品的变体。未经Promega事先明确的书面同意,不得擅自使用或转让本产品。

对于将Nano-Glo®品牌试剂用于向基因编码的自荧光蛋白以外的受体进行能量转移(如生物发光共振能量转移),研究人员必须:
(i)使用NanoBRET™品牌的能量受体(例如,bret优化的HaloTag®配体)对该产品的所有能量转移活性进行测定;或
(ii)联系Promega获得使用该产品的许可证,用于对非Promega制造的能量接收器进行能量转移分析。

关于本标签许可以外的任何用途,包括任何诊断、治疗、预防或商业用途,请联系Promega获取供应和许可信息。Promega对产品不作任何明示或默示的陈述或保证,包括关于适销性或适合某一特定用途的陈述或保证。本标签许可的条款应受美国威斯康辛州法律管辖。

通过使用本产品,研究者同意受此有限使用标签许可条款的约束。如果研究人员不愿意接受此有限使用声明的条件,且产品未使用过,Promega将接受未使用产品的退货,并为研究人员提供全额退款。

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此外,研究人员必须:
(1a)使用Nano-Glo®品牌发光检测试剂(LARs)对本产品及其衍生物的所有发光活性进行测定;或
(1b)联系Promega获得使用非Promega制造的LARs的产品及其衍生产品的许可。

对于将Nano-Glo®品牌LARs用于将能量转移(如生物发光共振能量转移)到基因编码的自荧光蛋白以外的受体,研究人员必须:
(2a)使用NanoBRET™品牌的能量受体(例如,bret优化的HaloTag®配体)对本产品及其衍生物的所有能量转移活性进行测定;或
(2b)联系Promega获得使用该产品及其衍生品的许可证,用于对非Promega制造的能量接收器进行能量转移分析。

研究人员可以将衍生品转让给他人用于研究用途,前提是在转让时将本标签许可的副本提供给接受者,而接受者同意受本标签许可条款的约束。关于本标签许可以外的任何用途,包括任何诊断、治疗、预防或商业用途,请联系Promega获取供应和许可信息。Promega对产品不作任何明示或默示的陈述或保证,包括关于适销性或适合某一特定用途的陈述或保证。本协议条款受美国威斯康辛州法律管辖。

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美国帕特。编号8,557,970、8,669,103、9,777,311、9,840,730、9,951,373和10,633,690;欧洲的帕特。编号2456864、2635595、3181687及3409764;日本的帕特。编号6038649、6155424、6227615及6374420;以及其他专利和未决专利。

美国帕特。No. 8,809,529,欧洲派特。2635582号,日本派特。5889910号等专利及未决专利。

美国帕特。编号:7,425,436,7,935803,8,466,269,8,742,086,8,420,367,8,748,148,9,416,353,9,593,316等专利及未决专利。

美国帕特。编号10,067,149和10,024,862,欧洲派。2932267号,日本派。6751294号、7092691号等专利及未决专利。

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