Live-Cell蛋白质相互作用
蛋白质:蛋白质相互作用(PPIs)是细胞信号转导网络的基本元素。虽然有许多方法可以在体外监测PPIs，但细胞内检测的方法比较有限。
NanoLuc®荧光素酶明亮的发光和小的尺寸允许使用BRET (NanoBRET™)或基于互补报告物(NanoBiT®)的方法在体内敏感地检测蛋白质相互作用。
本文介绍的NanoBRET™和NanoBiT®技术能够以以前不可能的方式检测内源性表达水平的蛋白质相互作用。可逆检测技术允许您在活细胞检测格式中使用NanoBRET™或NanoBiT®方法研究蛋白质相互作用的诱导和抑制，允许实时监测相互作用动力学。这两种技术都适用于台架规模或高通量多井板法。
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什么是活细胞蛋白质相互作用?
研究蛋白质之间相互作用的传统方法，如共免疫沉淀，不能提供细胞环境的数据。
利用生物发光共振能量转移(BRET)，可以定量测量活细胞中蛋白质之间的相互作用。在某些情况下，甚至可以实时测量这些相互作用，不仅可以观察相互作用的形成，还可以观察伴侣的分离。
BRET测量蛋白质相互作用使用生物发光供体融合到感兴趣的蛋白质和荧光受体融合到其结合伙伴。生物发光供体，通常是荧光素酶，不使用光激发荧光团，而是通过偶极-偶极耦合传递共振能量。为了传递共振能量，供体必须在受体10纳米范围内，并处于正确的方向，这使得该技术在近距离测量蛋白质时非常有用。生物发光供体和荧光受体之间的光谱重叠是实现最佳能量转移同时最小化背景信号的一个重要因素，需要适当的仪器来分离供体和受体信号。
蛋白质的相互作用也可以在活细胞中通过基于互补的分析检测到，当亚基成分被两个相互作用的蛋白质伙伴靠近时，就会产生一个活性的报告酶。基于互补性的分析通常提供报告活性的直接度量，且仪器要求更简单。
对于活细胞中的蛋白质相互作用研究，重要的是要确保所使用的技术不会显著干扰正常的蛋白质功能，并确保酶亚基在缺乏相互作用的蛋白质伙伴的情况下不会自我关联。Nanoluc®荧光素酶的小体积和明亮信号适应低表达水平的检测，对天然蛋白质功能的干扰最小。与活细胞检测相结合的NanoBiT®亚基的低自亲和力提供了活细胞中蛋白质相互作用动态的动态实时分析。
