简介gydF4y2Ba

细胞死亡即细胞命运:历史背景gydF4y2Ba

尽管细胞凋亡经常被描述为一个“热门话题”或生物学研究中“新的和爆炸性的”领域，但在Schleiden和Schwann提出细胞理论三年后，细胞死亡作为正常细胞命运的概念才被阐明。1874年，Vogt将自然细胞死亡描述为蟾蜍发育的一个组成部分(Cotter和Curtin, 2003)。自从这些早期的观察以来，自然细胞死亡被“重新”描述了好几次。1885年，弗莱明首次对细胞自然死亡过程进行了形态学描述，我们现在将其称为“细胞凋亡”，这是克尔及其同事创造的术语，用来描述与细胞死亡有关的不同于坏死的独特形态(克尔gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1972)。细胞凋亡研究的革命是对细胞凋亡的遗传程序和生化机制更好理解的直接结果。gydF4y2Ba

20世纪70年代和80年代的研究表明，细胞凋亡不仅具有特定的形态学特征，而且是一个具有特定生化特征的严格调控过程。对线虫细胞系的研究，gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba结果表明，细胞凋亡是线虫不变发育过程的正常特征。在1090个体细胞中gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba成年雌雄同体，131例在正常发育期间死亡(Hengartner, 1997)。通过记录从合子到成体的每一次细胞分裂，研究人员发现这131个细胞中的每个细胞的谱系和凋亡时间都是恒定的，这表明凋亡是一个严格调控的过程，可能是基因程序化的(即程序化细胞死亡)。在生化水平上，Wyllie表明，在凋亡过程中，DNA被特定的内切酶降解，导致由单核和寡核体大小的片段组成的DNA阶梯(Wyllie, 1980)。gydF4y2Ba

细胞凋亡形态学及概述gydF4y2Ba

形态学上，细胞凋亡首先表现为细胞折射率的变化(Hengartner, 1997)，然后是细胞质收缩和核凝结。根据细胞类型的不同，细胞膜开始出现气泡或刺突(细胞膜的突起)(图3.1)，最终这些泡突和刺突从死亡细胞中分离，形成“凋亡小体”。凋亡细胞也不再维持细胞膜上的磷脂不对称，磷脂酰丝氨酸(PS)出现在外叶上(Williamson, 2000)。线粒体外膜(MOM)也发生了变化，包括电化学梯度的丧失，这可能是由于MOM中孔隙的形成，以及细胞色素c等物质从MOM泄漏到细胞质中。最后，相邻细胞或巨噬细胞吞噬凋亡小体和死亡细胞。凋亡细胞不引起炎症反应，在体内只有个别细胞受凋亡影响。gydF4y2Ba

细胞凋亡事件与坏死事件相反，坏死首先以细胞膜完整性的丧失为标志。坏死细胞的细胞质和线粒体膨胀，最终细胞及其许多内部细胞器溶解。没有囊泡或凋亡小体形成，相邻细胞群常发生坏死。坏死的细胞残体被巨噬细胞吞噬，在体内引起炎症反应。gydF4y2Ba

细胞凋亡和坏死是细胞死亡连续体的两个极端。这个连续体包括许多变化。“类似凋亡的程序性细胞死亡”是指具有凋亡的一些特征的细胞死亡过程，如染色质凝结和细胞膜外单叶上出现PS，但不一定需要caspase活性(Leist和Jäättelä， 2001)。“类坏死程序性细胞死亡”描述的是不包括染色质凝结和具有不同程度的其他凋亡特征的程序性细胞死亡。Caspase-1和caspase-8与某些此类程序性细胞死亡病例有关(Leist和Jäättelä， 2001)。“旁凋亡”描述的是一种需要基因表达的细胞死亡，但在形态学上不类似于凋亡或坏死(SperandiogydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000)。gydF4y2Ba

此外，体外培养的凋亡细胞最终会发生“继发性坏死”。在长时间的孵育后，凋亡细胞最终停止代谢，失去膜的完整性，并将其细胞质内容物释放到培养基中(Riss和Moravec, 2004)。因此，已启动凋亡的细胞可能表现出一些与坏死相关的形态学表型。由于程序性细胞死亡有多种形式，包括形态学和生物化学，研究人员需要在精心选择的时间点检查多种生化标记，以确定他们的实验系统中细胞死亡的机制。gydF4y2Ba

细胞凋亡中的分子参与者gydF4y2Ba

还存在gydF4y2Ba

线虫的大规模诱变实验gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba发现了在发育过程中破坏程序性细胞死亡命运的突变gydF4y2BacegydF4y2Ba噢gydF4y2BadgydF4y2Ba地球异常(gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba基因(刺猬gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1983;Ellis和Horvitz, 1986)。的基因gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba-3被克隆出来，并被发现编码了一种含有a的蛋白酶gydF4y2BacgydF4y2Ba半胱氨酸在活性位点残留，并在氨基酸裂解后将底物裂解gydF4y2BaaspgydF4y2Baartate (gydF4y2BacaspgydF4y2Ba日月光半导体;元,J。gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1993)。遗传分析表明gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba细胞凋亡绝对需要-3gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

Caspases是一个在多细胞生物中高度保守的蛋白质家族。这个家族可以分为两个主要的亚家族:主要参与炎症反应并与caspase-1(白细胞介素-1β-转化酶)同源的caspases和与CED-3相关并主要参与凋亡的caspases。在大多数细胞类型中，半胱天冬酶都是作为不活跃的酶原组成表达的，在获得完全活性之前，酶原被蛋白水解处理。caspase酶原包含多个结构域，包括n端前结构域、一个大亚基和一个小亚基。半胱天冬氨酸酶的激活包括在大亚基和小亚基之间的特定的天冬氨酸上分裂酶原，并去除前畴。活性位点由含有一个大亚基和一个小亚基的异二聚体组成，充分活性的caspase蛋白是由两个异二聚体组成的四聚体(图3.2)。因为caspase作为酶原存在，它们的活性被认为主要是在翻译后被调节。然而，最近的研究表明，caspase-9基因的表达也受到转录调控(Csiszar, 2003)，内质网(ER)应激可以诱导转染细胞中小鼠caspase-12的表达(RaogydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2001)。gydF4y2Ba

人caspase-8和caspase-9通过两种不同的信号机制参与细胞凋亡的启动，被称为“启动型caspase”。它们可以通过蛋白水解过程激活效应因子caspase，包括caspase-3。反过来，caspase-3分裂下游靶标，不可逆地将细胞推向凋亡的命运。gydF4y2Ba

Bcl-2家族蛋白gydF4y2Ba

的基因gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba-9可防止细胞凋亡gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba，和遗传功能的丧失gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba-9导致细胞凋亡增加(HengartnergydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1992)。的gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba-9编码蛋白与gydF4y2Ba基类库gydF4y2Ba-2基因，参与人类淋巴瘤的原癌基因(Tsujimoto and Croce, 1986)。函数的守恒gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba9,gydF4y2Ba基类库gydF4y2Ba-2是通过转基因实验证明的gydF4y2Ba基类库gydF4y2Ba-2基因拯救gydF4y2Ba清洁能源gydF4y2Ba-9功能缺失表型gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba突变体(Hengartner和Horvitz, 1994)。Bcl-2蛋白家族包括大量共享Bcl-2同源(BH)结构域的蛋白质。从结构上讲，Bcl-2蛋白可分为三组。I组蛋白包括Bcl-2，这些蛋白具有抗凋亡作用。II和III家族成员是促凋亡的。第II族成员包含所有三个BH结构域;III族成员只包含BH-3结构域。Bcl-2家族的促凋亡成员参与渗透MOM和允许线粒体蛋白如细胞色素c泄漏。蛋白家族的抗凋亡成员，如Bcl-2，似乎通过隔离促凋亡蛋白或干扰其活性来保护细胞不发生凋亡(DanielgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。gydF4y2Ba

激活细胞凋亡gydF4y2Ba

许多外部刺激(外源性途径)可诱导细胞凋亡，包括激活细胞表面受体，如Fas、TNFR1(肿瘤坏死因子受体1)、TRAIL-R1(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体1)、TRAIL-R2、p75-NGFR (p75-神经生长因子受体)和其他(WajantgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。这些“死亡受体”有两个不同的信号基序:死亡结构域(DD)和死亡效应结构域(DED)，使它们能够与参与凋亡级联的其他蛋白质相互作用。通常情况下，外源性途径包括激活启动子caspase caspase-8，该启动子要么激活caspase-3，要么分裂Bcl-2家族成员Bid，导致凋亡细胞的形成和caspase-9的激活(Hengartner, 2000)。另一种线粒体途径(固有途径)可以通过DNA损伤等事件激活(RichgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1999)。线粒体途径包括调控线粒体细胞色素c释放的Bcl-2家族成员。gydF4y2Ba

其他研究表明，激活细胞凋亡的第三个途径可能与内质网有关。在小鼠中，caspase-12在内质网应激通路中诱导细胞凋亡(NakagawagydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000)。小鼠中的Caspase-12定位于内质网，并在内质网应激(如内质网中未折叠蛋白质的积累)时发生裂解gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000)。小鼠caspase-12激活似乎是由calpain和Ca介导的gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}内稳态可能是细胞健康的重要指标(RaogydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2001)。caspase -12缺乏的小鼠对淀粉样β (Aβ)诱导的细胞死亡不太敏感(Nakagawa, 2000)，这表明ER可能参与了Aβ诱导的细胞死亡途径。阿尔茨海默病的典型淀粉样斑块含有Aβ片段。这些Aβ片段具有神经毒性，与许多神经退行性疾病有关(Yuan和Yankner, 2000)。人类caspase-12的酶活性尚未被证实，但表达小鼠caspase-12的成神经细胞瘤细胞对内质网应激更敏感(HitomigydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。对与caspase-12密切相关的人类基因的筛选已经确定了人类caspase-4作为通过内质网应激途径激活凋亡的潜在候选基因(HitomigydF4y2Baet al。gydF4y2Ba2004)。当细胞被内质网应激诱导剂处理时，Caspase-4被裂解，在SK-N-SH成神经细胞瘤和HeLa细胞中，Caspase-4定位于内质网和线粒体(HitomigydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2004)。用caspase-4 siRNA处理细胞增加了它们对内质网应激诱导的细胞凋亡的抵抗力，也增加了SK-N-SH细胞对a β诱导的细胞死亡的抵抗力(HitomigydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2004)。gydF4y2Ba

Fas:死亡受体途径的一个例子gydF4y2Ba

当Fas受体与多价Fas配体(FasL)结合时，细胞表面的外源性信号传导可由Fas受体聚集启动。这种聚集使膜受体的细胞质结构域靠近，并诱导构象变化，从而组装信号复合体，死亡诱导信号复合体(DISC;图3.3)，在受体的细胞质尾部。一些研究表明，死亡受体可能通过预配体结合组装域(PLAD;陈gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000;西格尔,gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000)。DISC包括受体和配体以及一个“适配器”蛋白，Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)，它通过其c端DD结合到配体结合受体并招募procaspase-8。Procaspase-8通过自己的n端DED结构域与FADD的DED结合。由于DISC在配体结合的受体上形成，procaspase-8的几个分子被靠近，导致procaspase-8的局部高浓度。一种假设认为，procaspase-8的低内在活性允许procaspase-8酶原分裂并相互激活(诱导接近激活;Hengartner, 2000)。也有人提出对人类caspase-2和线虫CED-3进行诱导接近激活(Hengartner, 2000)。然而，其他研究表明caspase-8的激活需要二聚体(BoatrightgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。活跃的caspase-8异四聚体从DISC释放，可以自由裂解并激活效应子caspase-3。一个gydF4y2Ba动画演示gydF4y2Ba说明死亡受体途径是可行的。在一些细胞中，caspase-8导致了一个涉及到Bcl-2蛋白家族成员Bid的caspase-8切割的扩增环。Bid被切断后可诱导bax介导的细胞色素c从线粒体释放，使细胞进一步走向凋亡命运。gydF4y2Ba

线粒体途径(固有)gydF4y2Ba

线粒体途径涉及Bcl-2蛋白家族的成员，可被死亡受体途径激活(第1节)或其他与死亡受体无关的刺激，包括DNA损伤、拓扑异构酶抑制或营养因子退出(ParonegydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。许多II组和III组Bcl-2家族成员，如Bax、Bad和Bid，在线粒体和细胞的其他部分之间穿梭。它们的活性由多种机制调节，包括蛋白水解处理、磷酸化和抑制蛋白隔离。gydF4y2Ba

促凋亡信号引导II组和III组Bcl-2家族蛋白到达线粒体，在线粒体中，促凋亡的Bcl-2家族成员与抗凋亡的Bcl-2家族成员包括Bcl-2和Bcl-XL相互作用，以决定是否启动凋亡。如果促凋亡蛋白“获胜”，细胞色素c和其他分子从MOM中释放。一旦细胞色素c从线粒体中释放出来，它就能与Apaf-1(哺乳动物Apaf-1的同源物)相互作用gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2BaCED-4;邹gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1997年)，dATP和procaspase-9在一个叫做凋亡蛋白的蛋白质复合体中。当Caspase-9是凋亡小体的一部分时，它被加工和激活，在凋亡小体中它可以裂解和激活caspase-3。一个gydF4y2Ba动画演示gydF4y2Ba说明线粒体途径是可用的。gydF4y2Ba

细胞凋亡研究的临床应用gydF4y2Ba

许多疾病——癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏症和als——证明要么是凋亡未能消除有害细胞，要么是凋亡的不恰当激活导致必需细胞的丧失。凋亡调控的复杂性和凋亡信号通路中大量的分子参与者为开发调节该通路的治疗方法提供了充足的机会。潜在的治疗策略包括抑制或激活通路中涉及的特定蛋白质的小分子，针对凋亡中涉及的特定基因的反义寡核苷酸，以及能够使细胞膜受体寡聚以调节通路的抗体等gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。gydF4y2Ba

调控凋亡的一个明显的靶点是caspase家族的蛋白质。损伤后caspase激活的自然延迟为治疗提供了时间，靶向caspase的分子在临床前动物模型中显示出治疗潜力(Reed, 2002;尼克尔森,2000)。在小鼠缺血损伤模型中，caspases活性位点抑制剂已被使用，其结果是减少细胞凋亡，增加存活率和器官功能(Nicholson, 2000;HayakawagydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。Caspase抑制剂也被用于治疗小鼠败血症模型。在这些模型中，caspase抑制减少了淋巴细胞凋亡，提高了生存率。一家制药公司，Vertex，在治疗败血症的临床前试验中有一种caspase抑制剂(MurphygydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。gydF4y2Ba

被称为“凋亡抑制剂”的分子也是潜在的治疗靶点。这些抑制细胞凋亡的蛋白质在进化上是保守的。有些癌症过度表达IAPs，而IAP表达与细胞凋亡抵抗有关(Reed, 2002)。Survivin是一种IAP，与许多人类癌症相关，包括肺癌和恶性黑色素瘤(Nicholson, 2000)。消除survivin活性有可能使癌细胞对引发细胞凋亡的药物更加敏感。作为一种防止中风后过度细胞损失的方法，基因治疗策略中也正在研究内毒素(Reed, 2002)。gydF4y2Ba

死亡受体和线粒体通路都是潜在的治疗靶点。正常细胞和癌细胞对trail介导的凋亡表现出不同的敏感性，大约80%的人类癌细胞系对trail介导的凋亡敏感(Nicholson, 200)。在TRAIL (Apo-2L)与顺铂或依托泊苷联合使用的研究中，癌细胞凋亡增加(Nicholson, 2000)。在SCID小鼠的实验中，重组TRAIL能够减缓移植后肿瘤的生长或减小肿瘤的大小。重组TRAIL也显示出比CD95配体或TNF-α更低的肝毒性(Nicholson, 2002)。gydF4y2Ba

在线粒体通路中发挥重要作用的Bcl-2家族成员也成为制药公司的目标。Bcl-2蛋白在许多癌细胞中表达上调。反义Bcl-2寡核苷酸在SCID小鼠的临床前试验和III期临床试验中显示出了希望(Nicholson, 2000;里德,2002)。Bad是一个促凋亡的Bcl-2家族成员，与神经元凋亡有关。它是钙调蛋白/钙调蛋白依赖性磷酸酶的底物，Bad的去磷酸化使Bad结合并中和抗凋亡蛋白Bcl-XL。目前针对这部分凋亡通路的治疗方法包括钙调神经磷酸酶活性位点抑制剂和NMDA受体拮抗剂美金刚胺等化合物，可防止钙流入。美金刚胺用于治疗阿尔茨海默氏症和多梗死性痴呆的临床试验(Reed 2002)。gydF4y2Ba

许多其他凋亡信号通路中的调控者和参与者也成为开发治疗的目标。细胞中有许多信号级联影响细胞发生凋亡的决定。改变这些信号输入是影响细胞命运的另一种方式。MAPK家族成员、JUN激酶和AKT激酶通路都提供了可能调节靶细胞凋亡通路输入的途径(Reed, 2002;墨菲gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003;尼克尔森,2000)。gydF4y2Ba

关于自然细胞死亡的精确调控，仍有许多有待了解。了解这些细胞死亡途径将为影响和调节细胞死亡信号提供机会，以防止不适当的细胞死亡，或使用细胞自身的分子机制杀死不适当的分裂细胞。gydF4y2Ba

细胞凋亡检测方法与技术gydF4y2Ba

细胞凋亡是通过一个复杂的信号级联发生的，在多个点上受到严格调控，这为评估相关蛋白质的活性提供了很多机会。启动子和效应子caspases是检测细胞凋亡的特别好的靶点。这些无处不在的酶在细胞中作为不活跃的酶原存在，在形成活跃的异源四聚体之前被分裂，从而导致凋亡事件。针对特定的半胱天冬酶的发光和荧光底物使均相测定法得以发展，以检测其活性。此外，识别caspase活性形式或caspase裂解产物的特异性抗体可用于检测细胞内的凋亡。leyu乐鱼网荧光偶联半胱天冬酶抑制剂也可用于标记细胞内活性半胱天冬酶。gydF4y2Ba

除了监测caspase活性外，还有许多试剂可用于监测线粒体中指示细胞凋亡的分子，如细胞色素c。细胞凋亡的一些生化特征，如膜磷脂不对称丧失和DNA碎片化也可用于识别细胞凋亡。细胞活力测定可与细胞凋亡测定相结合，通过单一样品的多重分析提供更多关于细胞死亡机制的信息。本章的其余部分将描述允许您在各种实验系统中检测细胞凋亡的技术、协议和工具。gydF4y2Ba

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检测Caspase活性和激活gydF4y2Ba

荧光法测定半胱天冬酶活性gydF4y2Ba

半胱氨酸蛋白酶的半胱天pasase家族是蛋白水解级联的中心介质，导致细胞死亡和受损细胞的消除。因此，caspase在转录和内源性抗凋亡多肽上受到严格调控，这些多肽会阻止生产激活(EarnshawgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1999)。此外，参与这一过程的酶规定了不同的途径，并显示出与其主要生物学作用一致的专门功能(StennickegydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1999)。直接测定caspase活性的方法可以为研究人员提供关于死亡细胞死亡机制的有价值的信息。gydF4y2Ba

Caspase-Glo®测定法使用致发光的caspase-8四肽底物(z - letd -氨基荧光素)、caspase-9四肽底物(z - lehd -氨基荧光素)、caspase-3/7底物(z - devd -氨基荧光素)、caspase-6底物(z - veid -氨基荧光素)或caspase-2底物(z - vdvad -氨基荧光素)和专用缓冲液中的稳定荧光素酶。缓冲液针对特定的半胱天冬酶活性、细胞裂解和荧光素酶活性进行了优化。在缺乏活性的半胱天冬酶的情况下，半胱天冬酶底物不能作为荧光素酶的底物，因此不会产生光。当底物被各自的半胱天冬氨酸酶裂解时，氨基荧光素被释放出来，并有助于在发光反应中产生光(图3.4)。由此产生的发光信号与样品中存在的caspase活性的量成正比。gydF4y2Ba

caspase - glo®8,9和3/7分析试剂盒配置为易于使用，是可用的最敏感的caspase分析试剂盒。将缓冲液直接添加到冻干底物中制备试剂。这些均相试剂可以方便地以1:1的比例添加到样品中(图3.5)，无需单独的裂解步骤。因为发光信号“发光”而不是“闪烁”，所以不需要试剂注入器，该检测方法适用于高通量应用。图3.6显示了Caspase-Glo®3/7分析的线性关系。有关Caspase-Glo®检测的详细协议和更多背景信息，请参见技术公报#TB332、#TB333、#TB323、#TB366或#TB365。gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• Caspase-Glo®8检测和协议(Cat.#gydF4y2BaG8200gydF4y2Ba，gydF4y2BaG8201gydF4y2Ba，gydF4y2BaG8202gydF4y2Ba)， Caspase-Glo®9检测和协议(Cat.#gydF4y2BaG8210gydF4y2Ba，gydF4y2BaG8211gydF4y2Ba，gydF4y2BaG8212gydF4y2Ba)， Caspase-Glo®3/7检测和协议(Cat.#gydF4y2Ba(G8090gydF4y2Ba，gydF4y2BaG8091gydF4y2Ba，gydF4y2BaG8092gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
• 适于细胞培养的白壁多孔发光计板gydF4y2Ba
• 多通道移液器或自动移液站gydF4y2Ba
• 摇板机，用于混合多孔板gydF4y2Ba
• 可读取多孔板的光度计gydF4y2Ba
• 纯化的半胱天冬酶(如BIOMOL Cat)。# se - 172)gydF4y2Ba
• 10mM HEPES缓冲液(pH 7.4)与0.1%的Prionex®稳定剂稀释纯化酶gydF4y2Ba
• 半胱天冬酶抑制剂，如果进行半胱天冬酶抑制试验gydF4y2Ba

Apo-ONE®均相Caspase-3/7检测gydF4y2Ba

Apo-ONE®均相Caspase-3/7检测基于荧光前DEVD肽罗丹明110底物的裂解检测Caspase-3/7活性[(Z-DEVD)2-R110]。Apo-ONE试剂由缓冲液和底物结合而成。将试剂按试剂与培养基的1:1比例直接加入培养孔中。将内容物混合并孵育1-2小时或更长时间，并测量荧光信号。试剂渗透细胞释放半胱天冬酶，传递荧光前底物，并提供稳定半胱天冬酶活性的优化条件。由于R110荧光产物在活性caspase-3和-7存在的情况下持续积累，将潜伏期延长至18小时增加了信本比，提供了更大的灵敏度。只要保持1:1的比例，该方法易于扩展，以满足HTS筛选的小型化需求。图3.7提供了分析协议的概述。有关该系统的详细协议和背景信息，请参阅技术公报gydF4y2Ba# TB295gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• Apo-ONE®均相Caspase-3/7检测和协议(Cat.#gydF4y2BaG7790, g7791, g7792gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• 96孔或384孔不透明的白色或黑色平板，适合细胞培养(Nalge Nunc International有这种应用的FluoroNunc™产品)leyu乐鱼网gydF4y2Ba
• 荧光板读取器(如LabSystems Cat。# 9502887或等效)gydF4y2Ba
• 单通道和多通道移液器gydF4y2Ba
• 板振动器gydF4y2Ba

Caspase-3的原位标记:FITC-VAD-FMKgydF4y2Ba

CaspACE™FITC-VAD-FMK原位标记物是泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK(羧苯氧基-戊基-丙酰-天冬氨酸-[o -甲基]-氟甲基酮)的荧光模拟物。用荧光素异硫氰酸酯(FITC)取代羧苯氧基(Z) n端阻断基团，形成荧光凋亡标记物。这种结构允许抑制剂进入细胞，在那里它不可逆地结合激活的半胱天冬酶。FITC标签允许在原位测定半胱天冬酶活性时添加单一试剂。FITC-VAD-FMK Marker在DMSO中作为5mM溶液提供，用于通过荧光检测实时监测半胱天冬酶活性。建议用于抗fas处理的Jurkat细胞培养的浓度为10µM。gydF4y2Ba

Jurkat细胞凋亡的检测方法gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• CaspACE™FITC-VAD-FMK原位标记(Cat.#gydF4y2BaG7461gydF4y2Ba，gydF4y2BaG7462gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• 聚-gydF4y2BalgydF4y2Ba-赖氨酸涂层玻片gydF4y2Ba
• 抗fas单抗(克隆CH-11 MBL国际猫。# sy - 100)gydF4y2Ba
• 美国公共电视台gydF4y2Ba
• 福尔马林gydF4y2Ba
• 安装介质gydF4y2Ba
• 荧光显微镜gydF4y2Ba

1. 在1 × 10处播种Jurkat细胞gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba在37°C, 5% CO中，RPMI-1640 + 10% FBS中生长gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵育2-3天，直到密度达到5 ×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/毫升。gydF4y2Ba
   
   
2. 准备聚-gydF4y2BalgydF4y2Ba-lysine-coated幻灯片。在多室玻片的每个腔内涂上0.01%的聚乙二醇gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸的解决方案。当部分干燥时，用NANOpure®水冲洗玻片，然后风干。聚-gydF4y2BalgydF4y2Ba-赖氨酸涂层玻片可提前制备，并在4℃保存7天后使用。gydF4y2Ba
   
   
3. 添加抗fas单抗(克隆CH-11, MBL国际猫。# SY-100)至最终浓度为0.1µg/ml。不要添加到控件中。37°C孵育3-4小时。gydF4y2Ba
   
   
4. 将CaspACE™FITC-VAD-FMK In Situ Marker以10 μ M的终浓度添加到Jurkat细胞中。避光保护细胞，在培养箱中孵育20分钟。在剩下的步骤中，保持细胞避光。gydF4y2Ba
   
   
5. 离心机300gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba坚持5分钟。gydF4y2Ba
   
   
6. 用PBS冲洗细胞，然后用300度离心gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba坚持5分钟。gydF4y2Ba
   
   
7. 将细胞在PBS中悬浮至1.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升。gydF4y2Ba
   
   
8. 向多边形中添加细胞gydF4y2BalgydF4y2Ba-赖氨酸涂层玻片，室温下孵育5分钟，使细胞粘附在聚赖氨酸上gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸。gydF4y2Ba
   
   
9. 在室温下(避光)放入10%缓冲福尔马林中固定30分钟。gydF4y2Ba
   
   
10. 在PBS中冲洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
    
    
11. 在载玻片上添加安装介质和盖片。在荧光显微镜下分析。gydF4y2Ba
    
    

使用抗体检测活性Caspase-3gydF4y2Ba

Anti-ACTIVE®Caspase-3 pAb是一种凋亡标志物;它特异性地染色凋亡的人类细胞而不染色非凋亡的细胞。所有已知的半胱天冬酶都是由蛋白水解裂解激活的原酶合成的。Anti-ACTIVE®Caspase-3 pAb是一种亲和纯化的兔多克隆抗体，靶向于人Caspase-3 p18片段的肽段。该抗体使用caspase-3的裂解区对应的肽段进行亲和纯化。gydF4y2Ba

免疫化学染色通用方案gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• Anti-ACTIVE®Caspase-3 pAb (Cat。# G7481)gydF4y2Ba
• 制备，固定样品在载玻片上gydF4y2Ba
• 特里同®x - 100gydF4y2Ba
• 美国公共电视台gydF4y2Ba
• 阻断缓冲液(PBS/0.1%吐温®20 + 5%马血清)gydF4y2Ba
• 驴抗兔Cy®3偶联二抗体(Jackson Laboratories Cat。# 711-165-152)gydF4y2Ba
• 安装介质gydF4y2Ba
• 调湿室gydF4y2Ba

1. 在PBS/0.2% Triton®X-100室温下培养5分钟，使固定细胞通透。在PBS中洗涤三次，在柯普林瓶中，在室温下洗涤5分钟。gydF4y2Ba
   
   
2. 滤干载玻片，加入200 μ l阻断缓冲液(PBS/0.1%吐温®20 + 5%马血清)。建议使用偶联抗体宿主物种(或密切相关物种)的血清。将载玻片平放于加湿室中，室温孵育2小时。在PBS中冲洗一次。gydF4y2Ba
   
   
3. 在闭塞缓冲液中加入100 μ l的Anti-ACTIVE®Caspase-3 pAb，稀释1:250。准备一张没有Anti-ACTIVE®Caspase-3 pAb作为阴性对照的载片。将载玻片在加湿室中4°C孵育一夜。gydF4y2Ba
   
   
4. 第二天，在PBS中洗涤两次10分钟，在PBS/0.1%吐温®20中洗涤两次10分钟，在室温下在PBS中洗涤两次10分钟。gydF4y2Ba
   
   
5. 滤干载玻片，加入100µl的驴抗兔Cy®3共轭稀释1:50 00 PBS。(我们推荐Jackson实验室猫。# 711-165-152。)将载玻片平放于加湿室中，避光，室温孵育2小时。在PBS中洗涤两次5分钟，一次在PBS/0.1% Tween®20中洗涤5分钟，一次在PBS中洗涤5分钟，避免光照。gydF4y2Ba
   
   
6. 排干液体，将载玻片置于永久性或水性安装介质中，并在荧光显微镜下观察。gydF4y2Ba
   
   

使用抗裂解Caspase-3底物的抗体(Anti-PARP p85 Fragment pAb)gydF4y2Ba

聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)是一种参与DNA修复的核酶，是凋亡过程中caspase-3裂解的著名底物。抗PARP p85片段pAb是一种针对PARP p85片段的兔多克隆抗体，PARP p85片段是由caspase切割116kDa完整分子产生的，因此提供了凋亡的原位标记物。每批抗体经过免疫染色测试，含有足够的抗体，可在1:100的工作稀释下进行50次免疫细胞化学反应。gydF4y2Ba

免疫细胞化学通用方案gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 抗parp p85片段pAb (Cat。# G7341)gydF4y2Ba
• 细胞固定在载玻片上gydF4y2Ba
• 美国公共电视台gydF4y2Ba
• 阻断缓冲液(PBS/0.1%吐温®20 + 5%马血清)gydF4y2Ba
• 驴抗兔生物素结合物(杰克逊猫。# 711-065-152)gydF4y2Ba或gydF4y2Ba驴抗兔Cy®3共轭(杰克逊猫。# 711-165-152)gydF4y2Ba
• HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(如果使用生物素结合物)gydF4y2Ba
• DAB溶液(如果使用生物素偶联)gydF4y2Ba
• 超纯水gydF4y2Ba
• 调湿室gydF4y2Ba
• 过氧化物酶标记的链霉亲和素。， KPL猫。# 14-300-00，稀释1µg/ml PBS)gydF4y2Ba

1. 使细胞在室温下用0.2% Triton®X-100/PBS固定于载玻片5分钟。gydF4y2Ba
   
   
2. 在室温下用1倍PBS在coplin瓶中清洗5分钟。重复两次，总共洗3次。gydF4y2Ba
   
   
3. 沥干载玻片，加入阻塞缓冲液(PBS/0.1%吐温®20 + 5%正常血清)。用缓冲液覆盖细胞(每片200 μ l)。将载玻片平放于加湿室中，室温孵育2小时。gydF4y2Ba
   
   
4. 在PBS中冲洗一次。gydF4y2Ba
   
   
5. 加入100 μ l的Anti-PARP p85片段pAb稀释在阻塞缓冲液中。我们建议初始稀释比例为1:100。包括一张无Anti-PARP p85片段pAb的幻灯片作为阴性对照。将载玻片在加湿室中4°C孵育一夜。gydF4y2Ba
   
   
6. 第二天，在1X PBS中洗涤两次10分钟，在PBS/0.1% Tween®20中洗涤两次10分钟，在室温下在1X PBS中洗涤两次10分钟。gydF4y2Ba
   
   
7. 如果二抗是辣根过氧化物酶(HRP)偶联物，用0.3%的过氧化氢在室温下孵育4-5分钟即可阻断内源性过氧化物酶。如果您使用的是不同的二抗检测方法，请执行步骤9。gydF4y2Ba
   
   
8. 用1倍PBS在科普林瓶中清洗5分钟。重复两次，总共洗3次。gydF4y2Ba
   
   
9. 沥干载片，每载片加入100-200 μ l稀释二抗。我们推荐驴抗兔生物素结合物(杰克逊猫)。# 711-065-152)或驴抗兔Cy®3共轭(杰克逊猫。# 711-165-152)diluted 1:500 in PBS/0.1% Tween® 20. Lay the slides flat in a humidified chamber and incubate for 2 hours at room temperature.
   
   
10. 在1X PBS中洗几次。gydF4y2Ba
    
    
11. 生物素结合物沥干载片，每片加100-200μl链霉亲和素- hrp溶液。将载玻片平放于加湿室中，室温下孵育45分钟。对于酶标二抗体，请继续执行步骤13。对于其他二抗，请继续执行步骤15。gydF4y2Ba
    
    
12. 用1倍PBS在科普林瓶中清洗5分钟。重复两次，总共洗3次。gydF4y2Ba
    
    
13. 每片加100-200μl新制的DAB溶液。将载玻片平放，室温下孵育10分钟左右。gydF4y2Ba
    
    
14. 用NANOpure®水冲洗载玻片。弃置DAB前，经常使用漂白剂使其失去活性;但是，应遵循当地对危险废物的要求。gydF4y2Ba
    
    
15. 沥干液体，将载玻片置于永久或水性安装介质中(载玻片置于70%甘油中可在4°C或-20°C保存数周)。gydF4y2Ba
    
    

出生后0天小鼠大脑石蜡包埋切片染色方法。(所有步骤均在室温下进行。)gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 抗parp p85片段，pAb (Cat。# G7341)gydF4y2Ba
• 石蜡包埋，固定样品gydF4y2Ba
• hememode®(Fisher Scientific)或二甲苯gydF4y2Ba
• 乙醇(100,95和70%)gydF4y2Ba
• 美国公共电视台gydF4y2Ba
• 特里同®x - 100gydF4y2Ba
• HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba
• 生物素结合驴抗兔pAbgydF4y2Ba
• RTU ABC试剂(载体实验室)gydF4y2Ba
• DAB基板套件(Vector Laboratories)gydF4y2Ba
• VECTASHIELD®DAPI防褪色试剂(Vector Laboratories)gydF4y2Ba

1. 用4%多聚甲醛固定后将组织包埋在石蜡中。该协议使用6微米的部分。gydF4y2Ba
   
   注:动物解剖后灌注固定物和后固定物可获得最佳效果。gydF4y2Ba
   
   
2. 用Hemo De®(Fisher Scientific)或二甲苯洗涤纸巾3次，每次洗涤5分钟。用100%乙醇冲洗组织切片2分钟。将切片转移到95%乙醇中2分钟，然后转移到70%乙醇中2分钟。最后，将组织切片在PBS中冲洗2次，每次冲洗2分钟。gydF4y2Ba
   
   
3. 在PBS + 0.1% Triton®X-100中渗透10分钟。gydF4y2Ba
   
   
4. 在PBS中洗涤2次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
5. 用0.3% H孵育切片，阻断内源性过氧化物活性gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在PBS播出30分钟gydF4y2Ba
   
   
6. 在PBS中洗涤2次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
7. 在PBS + 5%驴血清中阻滞45分钟gydF4y2Ba
   
   
8. 与抗parp p85片段pAb在PBS + 1.0%驴血清中稀释1:50孵育60分钟。gydF4y2Ba
   
   
9. 在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
10. 与生物素结合的驴抗兔pAb (Jackson实验室)在PBS中稀释1:500孵育60分钟。gydF4y2Ba
    
    
11. 在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
    
    
12. 在RTU(准备使用)ABC试剂(矢量实验室)中孵育60分钟。gydF4y2Ba
    
    
13. 在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
    
    
14. 用DAB基板套件(Vector Laboratories)冲洗10分钟。gydF4y2Ba
    
    
15. 洗3次，每次在水中洗5分钟。gydF4y2Ba
    
    
16. 安装在VECTASHIELD®+ DAPI抗褪色试剂(Vector Laboratories)中。gydF4y2Ba
    
    
17. 立即使用荧光显微镜分析样品。gydF4y2Ba
    
    

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利用线粒体标记检测细胞死亡gydF4y2Ba

用线粒体染料检测细胞死亡gydF4y2Ba

虽然细胞凋亡的早期阶段不会导致线粒体代谢活性的立即改变，但在细胞凋亡过程中，线粒体外膜(MOM)的电化学梯度崩溃。一种理论认为，电化学梯度的变化是由线粒体中Bcl-2家族蛋白的激活和组装在MOM中形成的孔造成的。观察MOM性质变化的一种常用方法是使用荧光阳离子染料。在健康的非凋亡细胞中，亲脂性染料聚集在线粒体中。一旦分子在线粒体内达到临界浓度，它们就会形成聚集体，发出特定的荧光(阳离子染料JC-1的亮红色)。但是，在凋亡细胞中，MOM不维持电化学梯度，阳离子染料扩散到细胞质中，在那里，单体形式发出特定的荧光，不同于聚集形式的荧光(绿色为阳离子染料，JC-1;ZamazamigydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000)。gydF4y2Ba

其他线粒体染料可用于测定细胞内线粒体的氧化还原电位或代谢活性。在细胞死亡过程的后期，线粒体失去了代谢这些染料的能力。虽然线粒体染料可以提供关于细胞整体“健康”的信息，但它们不能专门处理细胞死亡的机制(凋亡或坏死)，通常与其他凋亡检测方法(如caspase检测)结合使用，以确定细胞死亡的机制(Zamzami)gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2000;沃特豪斯gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003)。gydF4y2Ba

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通过测量细胞膜的变化检测细胞凋亡gydF4y2Ba

正常情况下，真核细胞在细胞膜的内外小叶中保持着一种特殊的磷脂不对称。在细胞死亡期间，磷脂酰丝氨酸(PS)在外叶上变得丰富。检测这种磷脂不对称的变化是检测细胞死亡的一种方法。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和力。正常情况下，Annexin V不会与完整的细胞结合;然而，如果细胞死亡，膜联蛋白V会与细胞膜外叶的PS结合。如果Annexin V偶联到染料或荧光分子上，就可以用来标记凋亡细胞(van GenderengydF4y2Ba等gydF4y2Ba．2003;博西-韦策尔和格林，2000年)。gydF4y2Ba

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利用DNA片段检测细胞凋亡gydF4y2Ba

许多用来检测细胞凋亡的方法都是分析细胞凋亡过程中发生的DNA片段。在凋亡细胞中，基因组DNA被切割到180-200bp(基于核小体重复长度)的多聚体上。在凝胶电泳分析中，这种分裂的DNA很容易被观察到作为一个“阶梯”。为了在单细胞水平上检测这种DNA碎片，检测依赖于标记核小体片段的末端，然后用比色法或荧光法检测。死端™检测使用这种方法，通常称为TUNEL (tdt介导的dUTP缺口端标记)检测。在这个系统中，细胞经过处理，使膜可以渗透试剂和酶，以标记DNA片段。在细胞吸收了试剂后，多聚体的3 ' OH端被标记的荧光素-12- dutp (DeadEnd™荧光TUNEL系统)或生物素化核苷酸(DeadEnd™比色TUNEL系统)“尾随”。在荧光测定法中，产生的片段被荧光标记。在比色法中，使用链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶检测生物素化DNA片段。gydF4y2Ba

DeadEnd™荧光TUNEL系统gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• DeadEnd™荧光TUNEL系统(Cat。# G3250)gydF4y2Ba
• 美国公共电视台gydF4y2Ba
• 碘化丙啶(Sigma Cat)。# P4170)gydF4y2Ba
• 可选:gydF4y2BaSlowFadegydF4y2Ba®光抗褪色套件(分子探针猫。# S7461)或VECTASHIELD®(Vector Labs Cat.;# h - 1000)gydF4y2Ba
• 可选:vectashid®+ DAPI(矢量实验室猫。# h - 1200)gydF4y2Ba

培养细胞gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 1%无甲醇甲醛(polyciences Cat。# 18814)gydF4y2Ba
• 4%无甲醇甲醛(polyciences Cat。# 18814)gydF4y2Ba
• 70%的乙醇gydF4y2Ba
• 0.2% Triton®X-100溶液在PBSgydF4y2Ba
• 0.1% Triton®X-100溶液，PBS含5mg/ml BSAgydF4y2Ba
• DNase I(如RQ1 RNase-Free DNase, Cat。# M6101)gydF4y2Ba
• 20mM EDTA (pH 8.0)gydF4y2Ba
• DNase缓冲gydF4y2Ba
• 无dna RNase AgydF4y2Ba

用于石蜡包埋组织切片gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 4%无甲醇甲醛(polyciences Cat。# 18814)gydF4y2Ba
• 二甲苯gydF4y2Ba
• 乙醇(100%、95%、85%、70%和50%在去离子水中稀释)gydF4y2Ba
• 0.85% NaCl溶液gydF4y2Ba
• 蛋白酶K缓冲液gydF4y2Ba
• DNase我gydF4y2Ba
• DNase I缓冲液gydF4y2Ba

贴壁细胞和组织切片培养设备gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 聚-gydF4y2BalgydF4y2Ba-赖氨酸涂层或硅烷化显微镜载玻片gydF4y2Ba
• 细胞刮板gydF4y2Ba
• Coplin瓶(选择性DNase I阳性对照需要单独的瓶)gydF4y2Ba
• 钳gydF4y2Ba
• 用于显微镜载玻片的加湿室gydF4y2Ba
• 37°C孵化器gydF4y2Ba
• micropipettorsgydF4y2Ba
• 玻璃盖玻片gydF4y2Ba
• 橡胶水泥或透明指甲油gydF4y2Ba
• 荧光显微镜gydF4y2Ba

细胞悬浮液设备gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 台式离心机gydF4y2Ba
• 37°C培养箱或37°C覆盖水浴gydF4y2Ba
• 聚-gydF4y2BalgydF4y2Ba-赖氨酸涂层或硅烷化显微镜载玻片gydF4y2Ba
• Coplin瓶(选择性DNase I阳性对照需要单独的瓶)gydF4y2Ba
• 钳gydF4y2Ba
• 玻璃盖玻片gydF4y2Ba
• 用于显微镜载玻片的加湿室gydF4y2Ba
• micropipettorsgydF4y2Ba
• 流式细胞仪或荧光显微镜gydF4y2Ba

荧光显微镜检测细胞凋亡(方案)gydF4y2Ba

1. 将细胞贴在载玻片上，固定在无甲醇甲醛溶液中。gydF4y2Ba
   
   
2. 在PBS中清洗玻片，然后用Triton®X-100渗透。gydF4y2Ba
   
   
3. 用PBS冲洗玻片，然后用水龙头擦干。用平衡缓冲液预平衡幻灯片(室温下5-10分钟)。gydF4y2Ba
   
   
4. 解冻核苷酸混合物并准备rTdT孵育缓冲液，以进行技术通报#TB235中所述的反应和对照。gydF4y2Ba
   
   
5. 标签DNA链与荧光素-12- dutp在37°C的潮湿避光室中断裂60分钟。gydF4y2Ba
   
   
6. 将载玻片浸泡在2X SSC中(室温15分钟)停止反应。gydF4y2Ba
   
   
7. 将载玻片在PBS中洗涤3次，每片5分钟，以去除未结合的荧光素-12- dutp。gydF4y2Ba
   
   
8. 将载玻片浸泡在40ml刚稀释成1µg/µl的碘化丙啶溶液中，置于室温黑暗中15分钟，将样品置于科普林瓶中染色。gydF4y2Ba
   
   
9. 将载玻片在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
10. 立即使用荧光显微镜分析样品。或者，加入1滴抗褪色溶液(分子探针Cat。# S7461)到包含处理细胞的区域，并使用玻璃盖安装载玻片。用橡胶水泥或透明指甲油将边缘密封，晾干5-10分钟。gydF4y2Ba
    
    

悬浮细胞流式细胞仪分析(协议概述)gydF4y2Ba

1. 洗3-5 × 10次gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba用PBS将细胞用300℃离心gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba在4°C。重复这一步骤，用0.5ml PBS重悬。gydF4y2Ba
   
   
2. 加入5ml 1%无甲醇甲醛，在冰上放置20分钟或过夜，固定细胞。gydF4y2Ba
   
   
3. 用300度离心细胞gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba4℃浸泡10分钟，取上清液，用5ml PBS重悬细胞。重复清洗一次，用0.5ml PBS重悬细胞。gydF4y2Ba
   
   
4. 将细胞悬浮液加入5ml的70%冰冷乙醇中，在-20°C保存至少4小时。gydF4y2Ba
   
   
5. 用300度离心细胞gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba浸泡10分钟，然后在5毫升PBS中重新悬浮。重复离心并在1ml PBS中重悬细胞。gydF4y2Ba
   
   
6. 转移2 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞放入1.5ml的微离心管中。gydF4y2Ba
   
   
7. 离心机300gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba取上清10分钟，用80μl的equilibrium bration Buffer重悬。室温下孵育5分钟。gydF4y2Ba
   
   
8. 当细胞处于平衡状态时，将核苷酸混合物在冰上解冻，并根据技术公报#TB235为所有反应准备足够的rTdT孵育缓冲液。用反应次数乘以标准反应体积50μl，用2 × 10确定所需rTdT孵育缓冲液的总体积gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba
   
   阴性对照，制备不含rTdT酶的对照孵育缓冲液，用去离子水代替酶。gydF4y2Ba
   
   
9. 300 ×离心细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。取上清，在50μl rTdT孵育缓冲液中重悬。在37°C的水浴中孵育60分钟，避免光直接暴露。每隔15分钟移液一次，使细胞重悬。gydF4y2Ba
   
   
10. 加入1ml 20mM EDTA终止反应。轻轻地漩涡。gydF4y2Ba
    
    
11. 300 ×离心细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。除去上清液，在含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，用1ml 0.1% Triton®X-100溶液重悬颗粒。重复一次，总共冲洗2次。gydF4y2Ba
    
    
12. 300 ×离心细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。取上清，在0.5ml含250μg无dnase - RNase A的碘化丙啶溶液(鲜稀释至5μg/ml PBS)中重悬细胞颗粒。gydF4y2Ba
    
    
13. 在室温下，在黑暗中孵育细胞30分钟。gydF4y2Ba
    
    
14. 用流式细胞术分析细胞。测量荧光素-12- dutp在520±20nm处的绿色荧光和碘化丙啶在>620nm处的红色荧光。gydF4y2Ba
    
    

DeadEnd™比色TUNEL系统gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• DeadEnd™比色TUNEL系统(Cat。# g7360, g7130)gydF4y2Ba
• 磷酸盐缓冲盐水(PBS)gydF4y2Ba
• 0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶gydF4y2Ba
• 固定剂(例如，10%缓冲福尔马林，4%多聚甲醛，4%无甲醇甲醛)gydF4y2Ba
• 安装介质gydF4y2Ba

培养细胞gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 聚-gydF4y2BalgydF4y2Ba赖氨酸gydF4y2Ba
• 0.2% Triton®X-100溶液在PBSgydF4y2Ba
• DNase I(如RQ1 RNase-Free DNase, Cat。# M6101)gydF4y2Ba
• DNase缓冲gydF4y2Ba

用于石蜡包埋组织切片gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 二甲苯或二甲苯替代品[例如，Hemo-De®清洗剂(Fisher Cat。# 15 - 182 - 507 -))gydF4y2Ba
• 去离子水稀释乙醇(100%，95%，85%，70%和50%)gydF4y2Ba
• 0.85% NaCl溶液gydF4y2Ba
• 蛋白酶K缓冲液gydF4y2Ba
• DNase我gydF4y2Ba
• DNase I缓冲液gydF4y2Ba

组织切片和培养细胞设备gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 聚赖氨酸涂层或硅烷化显微镜载玻片gydF4y2Ba
• 钳gydF4y2Ba
• Coplin瓶(选择性DNase I阳性对照需要单独的瓶)gydF4y2Ba
• 用于显微镜载玻片的加湿室gydF4y2Ba
• 37°C孵化器gydF4y2Ba
• micropipettorsgydF4y2Ba
• 玻璃盖玻片gydF4y2Ba
• 清除指甲油或橡胶水泥gydF4y2Ba
• 显微镜gydF4y2Ba

细胞凋亡检测(方案)gydF4y2Ba

1. 将切片或细胞固定在显微镜载玻片上，用0.2% Triton®X-100在PBS中洗涤和渗透细胞，制备样品。gydF4y2Ba
   
   
2. 用equilibrium bration Buffer预平衡幻灯片。gydF4y2Ba
   
   
3. 标记DNA链与生物素化核苷酸混合物(在37°C下60分钟)断裂。gydF4y2Ba
   
   
4. 将载玻片浸入2X SSC中(室温15分钟)停止反应。gydF4y2Ba
   
   
5. 将载玻片在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
6. 用过氧化氢阻隔(室温3-5分钟)。gydF4y2Ba
   
   
7. 将载玻片在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
8. 加入稀释过的HRP链霉亲和素(室温30分钟)。gydF4y2Ba
   
   
9. 将载玻片在PBS中洗3次，每次5分钟。gydF4y2Ba
   
   
10. 添加DAB并显影(大约10分钟)。gydF4y2Ba
    
    
11. 用去离子水冲洗载玻片几次，用光学显微镜分析样品。gydF4y2Ba
    
    

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用两种或两种以上检测方法确认细胞凋亡gydF4y2Ba

通常，需要不止一种方法来确认细胞死亡是通过凋亡发生的。体外培养的细胞发生凋亡，最终发生继发性坏死。在长时间的孵育后，凋亡细胞最终停止代谢，失去膜的完整性，将胞质内容物释放到培养基中。凋亡的标记物如caspase活性可能只是短暂表达。因此，要确定细胞凋亡是否是细胞死亡的主要机制，了解模型系统中细胞死亡过程的动力学是至关重要的。如果需要关于细胞死亡机制的详细信息，接触毒素的时间、测试化合物的浓度和检测终点的选择就变得至关重要。gydF4y2Ba

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多路复用化验gydF4y2Ba

从同一个样本中收集多组数据的能力(即多路复用)正变得越来越重要。多路复用来自同一培养井的多个化验可以提供内部控制并消除重复工作的需要。图3.9显示了通过多路复用发光caspase-8和荧光caspase-3/7试验获得的数据。图3.10显示了在同一孔中依次复用细胞活力检测(CellTiter-Blue®检测)和半胱天冬酶检测(Apo-ONE®检测)的一个例子。下面我们提供了几个基于Promega细胞活力、细胞毒性和凋亡分析的多路复用的样本协议。这些协议旨在作为起点。与任何均相分析一样，复用分析需要对每个实验系统进行优化。我们强烈建议运行适当的控制，包括对样品单独进行每次测定。每种试验的附加背景、优化和推荐对照在每种试验的技术文献中都有提供。我们强烈建议在尝试多路复用实验之前阅读这些信息。gydF4y2Ba

区分Caspase-3/7和Caspase-8或-9活性(样本协议)gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• Caspase-Glo®8或9试剂(Cat.#gydF4y2BaG8200, g8201, g8202gydF4y2Ba或猫。#gydF4y2BaG8210, g8211, g8212gydF4y2Ba
• Apo-ONE®均相Caspase-3/7分析(Cat.#gydF4y2BaG7790, g7791, g7792gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• plate-reading光度计gydF4y2Ba
• 荧光版读取器gydF4y2Ba

1. 用感兴趣药物在96孔板中100 μ l的培养基中培养和处理细胞。gydF4y2Ba
   
   注意:通常有助于识别和包含诱导特定caspase反应谱的对照化合物(例如，外源性途径的tnf -超家族配体或激动剂或内源性途径的小分子诱导剂或诱导物)。此外，在测试化合物的同时，必须在匹配的井中加入车辆控制装置。gydF4y2Ba
   
   
2. 在细胞暴露于化合物的过程中，通过将Caspase-Glo®Buffer添加到冻干的底物中，制备Caspase-Glo®8或9试剂。gydF4y2Ba
   
   
3. 解冻Apo-ONE®底物，以1:20 00 50μl/10ml Caspase-Glo®8或9试剂稀释加入Caspase-Glo®8或9试剂中)。Apo-ONE®缓冲液将不用于本多重试验。屏蔽多路复用试剂的环境光，让它平衡到室温。gydF4y2Ba
   
   
4. 从培养箱(37°C)中取出电镀细胞，加入等量的复用试剂(如100μl至100μl)。gydF4y2Ba
   
   
5. 在轨道激振器上以500-700rpm的转速进行短暂混合，并屏蔽环境光。gydF4y2Ba
   
   注意:不鼓励用移液混合，因为它可能会产生过多的气泡。gydF4y2Ba
   
   
6. 室温下孵育30分钟至1小时，以获得与Caspase-Glo®8或9测定相关的稳态信号。测量发光。gydF4y2Ba
   
   
7. 读取485的荧光信号gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}/ 525gydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba
   
   请注意gydF4y2Bacaspase-3/7荧光强度随时间增加而增加。因此，在孵育2 - 3小时后，荧光信号可能更强。虽然发光Caspase-Glo®8或9测定物具有稳定的发光曲线，其半衰期接近5小时，但测量应在3小时内进行。gydF4y2Ba
   
   其他注意事项:gydF4y2Bacaspase -8和-9是激活效应子caspase -3或-7的启动酶。为此，多重分析的可用诱导窗口的动力学略有不同。尽管caspase-8或-9的最大活性反映了caspase-3或-7的活性，但其半衰期不同的方式与它们的生物学功能一致。换句话说，caspase-3或-7的可测时间可能比caspase-8或-9更短暂。最佳反应应通过时间过程研究来确定。gydF4y2Ba
   
   

荧光Caspase-3/7检测与细胞活力检测的复用(样品方案)gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• CellTiter-Blue®细胞活力测定法(Cat.#gydF4y2BaG8080, g8081, g8082gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• Apo-ONE®均相Caspase-3/7分析(Cat.#gydF4y2BaG7790, g7791, g7792gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• 荧光版读取器gydF4y2Ba

1. 用感兴趣药物在96孔板中100 μ l的培养基中培养和处理细胞。在最后1-2小时的处理中，直接向培养孔中加入20μl的CellTiter-Blue®试剂。gydF4y2Ba
   
   
2. 在处理期间，将培养皿放回培养箱。gydF4y2Ba
   
   
3. 记录560nm/590nm的CellTiter-Blue®荧光(活性)。gydF4y2Ba
   
   
4. 加入等量的Apo-ONE试剂(120μl/孔)。gydF4y2Ba
   
   
5. 记录Apo-ONE®荧光(caspase)在485gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}/ 527gydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba
   
   

荧光半胱天冬酶检测与荧光细胞活力检测的复用(样品方案)gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• CellTiter-Blue®细胞活力测定法(Cat.#gydF4y2BaG8080, g8081, g8082gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• Caspase-Glo®3/7检测试剂(Cat.#gydF4y2BaG8090, g8091, g8092gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• 荧光版读取器gydF4y2Ba
• plate-reading光度计gydF4y2Ba

1. 用感兴趣药物在96孔板100μl培养基中培养和处理细胞。gydF4y2Ba
   
   
2. 在最后1-2小时的处理中，加入20μl/孔的CellTiter-Blue®试剂，使用稀释1:4的Dulbecco's PBS。gydF4y2Ba
   
   
3. 在处理期间，将培养皿放回培养箱。gydF4y2Ba
   
   
4. 记录CellTiter-Blue®荧光(活力)560gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}/ 590gydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba
   
   
5. 加入等量Caspase-Glo®3/7试剂(120μl/孔)。水井会慢慢变成亮粉色。gydF4y2Ba
   
   
6. 室温孵育1小时，记录发光(caspase活性)。gydF4y2Ba
   
   

确定细胞毒性机制(样本方案)gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• CytoTox-ONE™均匀膜完整性检测(2X浓度;猫。#gydF4y2BaG7890, G7891gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• Caspase-Glo®3/7检测试剂(Cat.#gydF4y2BaG8090, g8091, g8092gydF4y2Ba）gydF4y2Ba
• 荧光版读取器gydF4y2Ba
• plate-reading光度计gydF4y2Ba

1. 用所述药物在96孔板中100 μ l的培养基中培养和处理细胞。gydF4y2Ba
   
   
2. 在2X浓度下重组CytoTox-ONE™底物，添加25μl/孔。gydF4y2Ba
   
   
3. 摇一摇，室温下孵育10分钟。记录荧光(560)gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}/ 590gydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba})，详见《CytoTox-ONE™系统技术公报#TB306》。gydF4y2Ba
   
   
4. 在每孔中加入等量(125μl)的Caspase-Glo®3/7试剂。gydF4y2Ba
   
   
5. 室温下孵育1小时，达到发光稳定状态。按照Caspase-Glo®3/7分析技术公报#TB323中描述的方法记录发光。gydF4y2Ba
   
   

评估基因调控和细胞凋亡(样本方案)gydF4y2Ba

材料要求:gydF4y2Ba

• 活细胞衬底(Cat;# e6481, e6482, e6485)gydF4y2Ba
• Apo-ONE®均相Caspase-3/7分析试剂(Cat。# g7790, g7791, g7792)gydF4y2Ba
• 转染适当Renilla荧光素酶报告基因的细胞gydF4y2Ba
• plate-reading光度计gydF4y2Ba
• 荧光版读取器gydF4y2Ba

1. 用感兴趣药物在96孔板90 μ l培养基中培养和处理细胞。gydF4y2Ba
   
   
2. 将endenren™底物(60μM final 10μl/孔)添加到含有药物处理过的细胞的部分孔中，37°C, 5% CO再孵育2小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．您可以在实验处理之前或之后添加底物，这取决于细胞对endenren™底物的耐受性。gydF4y2Ba
   
   
3. 记录发光。gydF4y2Ba
   
   
4. 加入等量的Apo-ONE试剂(100 μ l/孔)，室温孵育1小时。gydF4y2Ba
   
   
5. 记录荧光(485)gydF4y2Ba_{前女友gydF4y2Ba}/ 527gydF4y2Ba_{新兴市场gydF4y2Ba})．如技术公报TB295所述。gydF4y2Ba
   
   注:我们强烈推荐以下对照:单独添加Apo-ONE®试剂的药物处理细胞和单独添加endenren™底物的药物处理细胞。gydF4y2Ba
   
   

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诱导细胞凋亡的通用协议gydF4y2Ba

在实验系统中可通过多种方法诱导细胞凋亡，包括:gydF4y2Ba

用蛋白质合成抑制剂，异霉素，或DNA拓扑异构酶I抑制剂，喜树碱处理细胞，诱导人早幼粒细胞细胞系HL-60 (Del BinogydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1991;李gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1995;GorczycagydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1993;DarzynkiewiczgydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1992)。gydF4y2Ba

停用生长因子可诱导生长因子依赖性细胞系的凋亡。例如，ngf剥夺培养中的PC12细胞或交感神经细胞可诱导细胞凋亡(Batistatou and Greene, 1991)。gydF4y2Ba

糖皮质激素地塞米松体外治疗诱导小鼠胸腺淋巴细胞凋亡(GavrieligydF4y2Ba等gydF4y2Ba．1992;科恩和杜克1984年)。gydF4y2Ba

通过各自的配体或与激动剂抗体交联激活Fas或TNF受体可诱导Fas-或TNF受体细胞的凋亡(Tewari和Dixit 1995)。gydF4y2Ba

抗fas单抗诱导Jurkat细胞凋亡gydF4y2Ba

1. 在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在5%湿润CO中培养Jurkat细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37°C培养箱。gydF4y2Ba
   
   
2. 将细胞置于新鲜培养基中，浓度为1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/毫升。在37°C, 5% CO中孵育2 - 3天后gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba培养箱，用300-350度离心收集细胞gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba坚持5分钟。gydF4y2Ba
   
   
3. 在5 × 10的新鲜培养基中重悬细胞gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ml，加入抗fas mAb至终浓度为0.05-0.1µg/ml。在37°C培养箱中孵育3-6小时。作为阴性对照，在相同条件下培养未处理的细胞(无抗fas单抗)。(在此进行均匀试验，或将细胞置于96孔板中。)gydF4y2Ba
   
   
4. 用300-350度离心收集细胞gydF4y2Ba×ggydF4y2Ba坚持5分钟。gydF4y2Ba
   
   
5. 除去所有培养基，在PBS中重悬细胞。gydF4y2Ba
   
   
6. 重复离心，在PBS中重悬细胞颗粒至1.5 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升。gydF4y2Ba
   
   

异霉菌素诱导HL-60细胞凋亡gydF4y2Ba

用蛋白合成抑制剂处理，异霉素诱导人早幼粒细胞细胞系HL-60的凋亡。gydF4y2Ba

1. HL-60细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中在5%的湿化CO中生长gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37°C培养箱。gydF4y2Ba
   
   
2. 调整细胞密度为5 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba用终浓度为2μg/ml(溶解在DMSO中)的异霉素处理。在5%的加湿CO中孵育2小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba37°C培养箱。用等量DMSO处理阴性对照细胞，在相同条件下孵育。gydF4y2Ba
   
   
3. 收集细胞并在PBS中重悬至1.5 x 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba/毫升。gydF4y2Ba
   
   

staaurosporin诱导SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞凋亡gydF4y2Ba

1. 将火腿的F12营养物质和添加10%胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素的最低必需培养基1:1混合培养细胞，在95%空气和5% CO的气氛中培养细胞gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在37°C。gydF4y2Ba
   
   
2. 允许细胞达到70%的汇合。胰蛋白酶将细胞从烧瓶中释放出来，并在96孔板中放置45% MEM, 45% F12K和10% FBS。gydF4y2Ba
   
   
3. 24 h后，用3.125 μ M staurosporine在DMSO中处理细胞100μl。gydF4y2Ba
   
   
4. 与斯陶孢素孵育24小时后，进行细胞基础测定。gydF4y2Ba
   
   

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参考文献gydF4y2Ba

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