报告基因及其应用

什么是记者基因?

报告基因是与启动子序列或表达载体中的元素连接的外源性编码区域，被引入细胞中以提供测量启动子活性的手段。一旦在细胞中表达，报告蛋白就可以通过直接测量报告蛋白本身或评估其酶活性来进行检测，并将融合启动子元件的强度与报告蛋白产生的数量相关联。理想的报告基因不是在感兴趣的细胞中内源性表达的，并且能够接受敏感、定量、快速、容易、准确、可重复和安全的检测。

记者Gene的角色是什么?

报告基因及其相关检测方法对真核生物基因表达和调控的研究有重要贡献。尽管报告基因在体外和体内的许多应用中都发挥了重要作用，但它们最常被用作细胞转录活性的指标。

分析独联体-作用转录元件是报告基因的一种常见用途。由于报告蛋白的表达与报告基因的转录活性相对应，报告载体，即含有报告基因的质粒，被用于识别和表征启动子和增强子元件的功能。在这类研究中，启动子序列被克隆到基因的上游或下游。通过标准转染方法将启动子-报告基因融合导入培养细胞或导入生殖细胞以产生转基因生物。因此，您可以通过使用报告基因来描述调控细胞、组织和发育定义基因表达的启动子和增强子元素。

来分析反式-作用因子时，启动子-报告基因融合DNA与另一个表达反式作用蛋白或感兴趣的RNA的克隆DNA共转染，或通过样品处理激活反式作用因子。该蛋白可能是一种转录因子，与报告基因上游克隆的相关启动子区域结合。例如，当HIV-1中的转激活蛋白tat蛋白从转染细胞中的一个载体表达时，与报告基因相关的不同HIV-1长端重复序列(LTR)的活性增加，报告基因蛋白活性相应增加。

除了评估启动子活性外，报告子通常被用于研究非翻译区域(utr)对mRNA稳定性、蛋白质定位和翻译效率的影响。例如，microRNA (miRNA)靶点可以插入到报告基因的下游或3´以研究microRNA如何影响RNA稳定性。

如何测量报告基因活性?

报告基因或从报告基因序列翻译而来的蛋白质可以通过检测酶活性或分光光度特性进行分析，也可以通过基于抗体的间接分析进行分析。一般来说，由于生成可检测水平的反应产物所需的报告酶的数量较少，酶法测定更加敏感。leyu乐鱼网如果细胞中存在内源性酶活性(例如，β-半乳糖苷酶分解乳糖)，酶学测定的一个潜在局限性是背景高。基于抗体的检测通常不太敏感，但可以检测出报告蛋白，无论它是否具有酶活性。

从根本上说，报告分析使用蛋白质来测量生物结果，使用可观察的参数，如生物发光。

光子主要是通过化学发光和荧光产生的，这是能量从激发态分子轨道转移到低能量轨道的结果。然而，激发态轨道是不同的。在化学发光中，激发态是放热化学反应的产物，而在荧光中，激发态是由光的吸收产生的。

激发态产生的这种差异极大地影响了分析的特性。例如，基于荧光的分析往往更亮，因为高强度的光可以用来产生激发态。在化学发光分析中，化学反应通常产生较低的光子发射率。更大的荧光亮度似乎与更好的检测灵敏度相关，但通常情况下并非如此。测定灵敏度由相对于背景的信号的统计分析决定，其中相对信号由样品测量减去背景测量组成。荧光分析往往有更高的背景，导致较低的相对信号。

荧光分析中较高的本底主要是因为荧光计不能完全区分进入样品的非常高的光子流入和从分析荧光团发射的小得多的光子。这种辨别很大程度上是通过光学过滤完成的——发射光子的波长比激发光子长——还有几何原理，因为发射光子的路径通常与激发光子不同。然而，光学滤波器在区分波长方面并不完美，光子可以通过散射改变方向。化学发光的优点是，由于不需要光子来产生激发态，所以在测量从样品流出的光子时，它们不构成固有的背景。由此产生的低背景可以精确测量光的微小变化。

了解更多关于生物发光的优势这篇文章．

生物发光是生物自身发光的一种自然现象。生物发光的基础是酶荧光素酶与发光底物(如荧光素)相互作用产生光(图1)。使用最广泛的荧光素酶是甲虫荧光素酶(包括萤火虫荧光素酶)，Renilla荧光素酶和修饰的深海虾荧光素酶(NanoLuc®荧光素酶)。荧光素酶基因已经从细菌、甲虫(如萤火虫)、Renilla、深海虾(Oplophorus)，Aequorea，Vargula而且Gonyaulax(腰鞭毛虫)。其中，只有来自细菌，甲虫，深海虾和Renilla发现了作为报告基因评估转录表达的普遍用途。这里我们描述了常用的荧光素酶报告基因。

生物发光检测分析的基础是利用酶及其底物的高效发光化学，用于分析方法。通过保持每个反应组分的浓度恒定，除了一个组分随被研究过程而变化外，产生的光与可变组分成正比。这将一个可观察的参数与反应结果相结合。在使用荧光素酶的测定中，可变组分可能是荧光素酶本身、其底物或辅助因子。由于生物发光的背景很低，比例线性范围可以很大，通常延伸到10⁴- 10⁸-倍于可变组分的浓度。

细胞内荧光素酶的定量通常通过添加含有洗涤剂的缓冲溶液来溶解细胞和荧光素酶底物来启动发光反应。发光慢慢衰减，随着时间的推移，信号逐渐减弱。为了使萤火虫和Renilla荧光素酶测定物在较长时间内(从几分钟到几小时)保持稳定的发光，需要不同程度地抑制发光反应。即使在这些条件下，也只有10个^-20年每个样品的荧光素酶的摩尔数或更少可以被量化。这相当于每个细胞大约有10个分子。

相比之下，NanoLuc®荧光素酶的信号半衰期更长。基于NanoLuc®的分析，使用新型呋喃咪嗪基板来测量NanoLuc®荧光素酶活性，显示出更明亮的信号和更慢的发光衰减速率，信号半衰期约为120分钟。这些延长的半衰期测定为报告基因的应用提供了便利。只需添加试剂，并测量产生的发光。

大多数报告基因检测涉及一个或两个报告基因。通常情况下，第二个报告器由一个“控制”向量表示，以规范化实验报告器的结果。例如，第二个报告基因可以控制细胞数量或转染效率的变化。通常情况下，控制报告基因由组成启动子驱动，控制载体与“实验”载体共转染。不同的报告基因用于对照和实验载体，以便分别测定两个报告产物的相对活性。leyu乐鱼网下面的报告基因分析简介动画演示了报告基因分析的基本设计，以双荧光素酶报告基因分析系统为例，研究启动子结构、基因调控和信号通路。

或者，你可以设计双报告基因分析，其中两个报告基因都用作实验报告基因。这种双报告分析方法对于在单一实验中有效地提取更多信息特别有用。关于在双荧光素酶试验中使用一个或两个实验报告者的更多信息，请阅读文章如何选择NanoDLR™双报告基因分析格式．

以下部分提供了关于特定生物发光报告基因分析的信息，帮助您选择适合您的研究需要的报告基因和分析方法。表1，2而且3.总结现有的荧光素酶基因、分析方法和试剂。

记者化验

基于单个报告的分析提供了从细胞中获取基因表达数据的最快方法。然而，由于细胞本身是复杂的，从单一报告基因分析中收集的信息可能不足以获得详细和准确的结果。因此，在选择报告方法学时的首要考虑之一是确定来自单个报告方法学的信息是否足够，或者是否可以从从第二个报告方法学中收集到的附加信息中获益(例如，转染效率或细胞数量差异的规范化)。如果需要更多信息，请参见下面的双报告分析部分。

当选择荧光素酶测定法时，通常需要在发光强度和持续时间之间权衡，因为明亮的反应消退相对较快。用萤火虫或Renilla荧光素酶法能产生最大的发光，因此具有较高的灵敏度，但在多孔板中进行检测时，使用具有较长信号半衰期和更稳定的发光信号的检测方法更方便。在延长半衰期的萤光素酶测定中，有ONE-Glo™荧光素酶检测系统(猫。# E6110)和ONE-Glo™EX荧光素酶检测系统(猫。# E8110)。ONE-Glo™荧光素酶检测系统产生最大的发光强度，具有45分钟的半衰期，并对非最佳反应条件更耐受。ONE-Glo™EX试剂具有较长的信号半衰期(约2小时)，一旦重组，在4℃或室温下更稳定，细胞培养基中酚红的干扰更少，气味比其他荧光素酶检测试剂更少。

的Steady-Glo®荧光素酶检测系统提供更长的发光持续时间，但强度较低。Steady-Glo试剂直接添加到哺乳动物细胞的培养基中，因此无需预先裂解细胞。这允许您在多孔板中培养细胞，然后在一个步骤中测量报告基因表达。Renilla荧光素酶测定具有不同的信号强度和半衰期也可用。

NanoLuc®荧光素酶不需要为信号半衰期牺牲发光强度。的纳米glo®荧光素酶检测系统(猫。# N1110)提供了一种简单的单次添加试剂，在常用的组织培养基中产生半衰期约为120分钟的发光型信号。该试剂包含完整的裂解缓冲液，可直接用于表达NanoLuc®荧光素酶的细胞，但也与含有分泌荧光素酶的培养基兼容。

Dual-Reporter化验

在一个测定法中测定两个报告者称为双报告者测定法，如果两个报告者都是荧光素酶，则称为双荧光素酶测定法。虽然最常用的双报告者测定法同时测定萤火虫和Renilla荧光素酶活性，但下一代双荧光素酶测定法使用NanoLuc和萤火虫荧光素酶。这对荧光素酶使用不同的底物，因此可以根据其酶的特异性进行区分。大多数双荧光素酶检测都需要在每个样品中加入两种试剂，然后测量每次加入后的发光。加入第一试剂激活第一个荧光素酶报告反应;加入第二种试剂会熄灭第一个荧光素酶报告活性，并启动第二个荧光素酶反应。

的Nano-Glo®双荧光素酶报告检测系统(猫。# N1610)测量萤火虫和NanoLuc®荧光素酶活性。这种报告和检测的结合有几个优点，包括较低的背景水平，因为更好地猝灭萤火虫荧光素酶活性和更高的灵敏度，因为更明亮的NanoLuc®发光。较长的信号半衰期(萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶约2小时)使该方法特别适用于高通量筛选。此外，较低的萤光荧光素酶背景和较亮的NanoLuc®信号使检测配置具有更大的灵活性。NanoLuc®或萤火虫荧光素酶都可以作为实验报告基因，另一个荧光素酶用作归一化对照，或者两个报告基因都可以作为实验报告基因，为您从一组检测中提供更多的信息。

较老的双报告基因分析技术是双荧光素酶报告检测系统(猫。# E1910)，它测量了萤火虫和Renilla荧光素酶活性的序列从一个单一的样本。该系统需要在进行检测之前裂解细胞，并需要使用多孔板试剂注入器。

的Dual-Glo®荧光素酶检测系统也测量了萤火虫和Renilla荧光素酶活性从单个样品，并提供较长的荧光素酶信号半衰期，这是有用的，当执行报告分析在多孔板。与设计用于多孔板的其他试剂一样，Dual-Glo®检测方法直接在哺乳动物细胞培养基中工作，无需事先进行细胞裂解。

一般来说，双报告分析通过以下方法提高实验的准确性和效率:i)减少可能模糊有意义相关性的可变性;Ii)规范化实验系统中可能固有的干扰现象;iii)归一化样品间转染效率的差异。此外，由于在高通量筛选中化合物与报告蛋白的直接相互作用，双报告蛋白检测可以减少非相关的命中数(即“假”命中数)。使用共发报告物——具有不同化合物干扰谱的报告物——可以帮助区分调节感兴趣的生物途径的化合物与那些影响报告酶的稳定性或活性的化合物。

减少可变性

由于细胞是复杂的微环境，一个实验中的样品之间以及在不同时间进行的实验之间可能会发生显著的变化。挑战包括保持样品间均匀的细胞密度和活力，以及完成外源DNA的可重复性转染。多井板的使用引入了一些变量，如边缘效应，这是由热分布和板上湿度的差异带来的。双报告因子分析可以控制这种变异的大部分，导致样本之间更准确和有意义的比较(Hawkins等．2002;汉娜et al。1998;木,1998;Faridiet al。2003)。

Live-Cell基质

研究人员努力在对细胞影响尽可能小的情况下监测细胞活动。大多数报告酶活性测定使用终点裂解方法来破坏细胞，以便报告酶周围的环境可以被仔细控制。然而，使用非溶酶分析方法来测量报告基因活性有其优点，包括随着时间的推移持续监测表达变化和与评估细胞健康的分析方法的复用。Promega的科学家已经开发了多种活细胞基质，在不破坏细胞的情况下监测荧光素酶活性。

通过向培养基中添加单一试剂，NanoLuc®荧光素酶活性可以监测数小时甚至数天。的纳米glo®活细胞检测系统可以监测记者活动长达2小时，与最大的光强度。如果时间较长，则Nano-Glo®Vivazine™活细胞基板可以在数小时内监测NanoLuc®的活性，但当纳米glo®Endurazine™活细胞基质在连续数天监测报告活性方面具有最佳的信号稳定性，但NanoLuc®底物的信号强度最低。这些活细胞检测试剂可以为研究蛋白质相互作用和简化时间过程研究提供报告基因表达的动力学测量。
Renilla荧光素酶只需要氧气和腔肠嗪就能产生发光，这为测量活细胞的发光提供了一个简单的荧光素酶系统。的EnduRen™而且ViviRen™活细胞底物克服了腔肠嗪在水溶液中的不稳定性，容易使表达的活细胞发光Renilla荧光素酶。因为细胞仍然是活的，你可以通过与另一种试验的多路复用来确定活细胞的数量。

另一种活细胞基质的替代品是一种分泌形式的报告蛋白，它可以通过测量细胞培养基中的报告活性来量化。NanoLuc®荧光素酶融合到氨基端分泌信号提供分泌表单(secNluc)，在报告分析之前或期间不需要细胞裂解。

记者分析资源乐鱼体育是什么

• 记者分析:
  使用NanoLuc®荧光素酶和GloMax®Discover系统检测生理水平的HIF1α表达
• Dual-Reporter化验:
  选择荧光素酶报告试验:比较指南
  设计生物发光报告试验:选择你的实验报告
  设计一种生物发光报告分析方法:归一化
  使用NanoDLR™双荧光素酶检测系统混合和匹配主报告和对照报告

报告基因的传统用途主要是分析基因表达和解剖顺式作用的基因元件，如启动子和增强子(所谓的“启动子冲击”)的功能。在典型的实验中，缺失或突变发生在启动子区域，它们对报告基因偶联表达的影响是定量的。然而，报告基因也可以用于研究其他细胞事件，包括与基因表达无关的事件，如细胞健康和信号通路。有关更多信息，请查看以下生物发光分析介绍动画。

细胞生理变化归一化

与细胞生理相关的事件可以影响报告基因的表达。特别值得关注的是细胞毒性的影响，当使用单一报告试验时，细胞毒性可以模拟基因下调。报告因子分析可以与细胞活力或细胞毒性分析进行复用，以独立监测报告因子表达和细胞活力，以避免数据误解(Farfan等．2004)。多路检测的使用允许细胞内事件的相关性，如RNAi靶抑制的耦合作用，对细胞生理的影响(Hiroseet al。2002)。

发光细胞活力或细胞毒性测定，如CellTiter-Glo®2.0细胞活力测定(猫。# G9241)和CytoTox-Glo™细胞毒性试验(猫。# G9290)，使用稳定的萤火虫荧光素酶产生发光信号，表明细胞健康。因为这些检测方法含有萤火虫荧光素酶，所以不能直接与萤火虫荧光素酶报告检测相结合。然而，这种检测方法可以很容易地与非破坏性荧光素酶检测相结合。例如，定量NanoLuc®荧光素酶的表达，方法是将其中一种Nano-Glo®活细胞基质添加到培养基中并测量发光。当报告物测量完成后，将CellTiter-Glo®2.0或CytoTox-Glo™试剂添加到样品中，使NanoLuc®荧光素酶失活并启动发光以评估细胞活力。或者使用Nano-Glo®萤光素酶测定系统从一种培养基中测量分泌的NanoLuc®报告蛋白的活性。

或者，您可以将发光报告检测与荧光细胞活力和细胞毒性检测进行复合，以监测细胞健康并使单报告检测结果规范化。例如,CellTiter-Fluor™细胞活力测定(猫。# G6080)是一种非溶性的荧光分析方法，用于测量种群中存活细胞的相对数量。的CellTox™绿色细胞毒性检测(猫。# G8741)使用一种专利染料，它可以从活细胞中分离出来，但优先结合死细胞的DNA。在DNA结合后，染料的荧光大大增强，产生的荧光与细胞毒性水平成正比。这些细胞健康检测非常适合与均相荧光素酶检测试剂，如Bright-Glo™，Steady-Glo®和ONE-Glo™荧光素酶检测系统(Zakowicz等．2008年),Renilla-Glo®荧光素酶检测系统以及纳米glo®活细胞基质。

报告分析和细胞运行状况乐鱼体育是什么附加资源

• 文章:通过分析多路复用使你的基因报告数据有意义

监控RNA干扰

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指与靶mRNA互补的双链RNA通过刺激靶mRNA的降解，特异性地使基因失活的一种现象。因此，RNAi或更一般的RNA沉默已经成为分析基因功能的强大工具。

生物发光报告器已被用于研究RNAi。例如,pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体(猫。# E1330)是基于双荧光素酶技术，以萤火虫荧光素酶作为主要报告者来监测mRNA调控和Renilla荧光素酶作为常态化的对照报告。pmirGLO载体通过插入下游或萤火虫荧光素酶基因3´的miRNA靶点，定量评估microRNA (miRNA)活性。萤火虫荧光素酶表达的减少表明内源性或引入的miRNA与克隆的miRNA靶序列结合。

评估细胞信号通路

荧光素酶报告检测被广泛用于研究细胞信号通路和作为药物发现的高通量筛选工具(Brasier等．1992年,壮族等．2006)。合成结构与克隆的调控元件指导报告基因表达可用于监测信号转导和识别相关的信号通路。通过将荧光素酶的表达与报告结构中的特定反应元件(REs)联系起来，用这种结构转染细胞，添加特定的处理，然后测量报告活性，研究人员可以确定使用了什么REs，从而确定参与了什么信号通路。抑制剂和sirna的使用可以用来确认哪些因素参与了这种反应。

有各种各样的萤火虫荧光素酶pGL4载体，您可以选择一些响应元素和调节序列，用于表征和调节信号通路。例如，CREB, CRE和STAT5RE可用于您的研究。看到表1查看完整的列表。许多这些载体编码湿霉素抗性基因，以允许选择稳定转染的细胞系。

研究核受体

生物发光报告基因还可以表征核受体，核受体是一类配体调节的转录因子，能够感知细胞内类固醇和其他分子的存在。核受体通常存在于细胞质中，通常与相关的调控蛋白结合。配体结合触发转位进入细胞核，在细胞核中，受体通过dna结合域与特定的反应元件结合，导致邻近基因的上调。生物发光报告器可以利用一种通用的受体测定法来识别和表征核受体激动剂、拮抗剂、辅抑制剂和辅激活剂。通用核报告基因检测可被认为是一种“单杂交”检测，其中核受体的配体结合域(LBD)与酵母GAL4转录因子融合，当配体与核受体结合时，萤火虫荧光素酶表达(图8)。