报告基因及其应用

什么是记者基因?

报告基因是与启动子序列或表达载体中的元件相连的外源性编码区域，被导入细胞以提供测量启动子活性的手段。一旦在细胞中表达，通过直接测量报告蛋白本身或评估其酶活性，将融合启动子元件的强度与产生的报告量相关联来分析报告蛋白。理想的报告基因在感兴趣的细胞中不是内源性表达的，并且易于进行敏感、定量、快速、简单、准确、可重复和安全的分析。

记者吉恩的角色是什么?

报告基因及其相关检测方法为真核生物基因表达和调控的研究做出了重要贡献。尽管报告基因在体外和体内的许多应用中发挥了重要作用，但它们最常被用作细胞转录活性的指标。

分析独联体-作用转录元件是报告基因的一种常见用途。报告载体，包含报告基因的质粒，用于识别和描述启动子和增强子元件的功能，因为报告蛋白的表达与报告基因的转录活性相对应。对于这些类型的研究，启动子序列被克隆在基因的上游或下游。通过标准转染方法将启动子-报告基因融合引入培养细胞或引入生殖细胞以产生转基因生物。因此，您可以通过使用报告基因来描述调节细胞、组织和发育定义的基因表达的启动子和增强子元件。

来分析反式-作用因子时，启动子-报告基因融合DNA与另一个表达感兴趣的反式作用蛋白或RNA的克隆DNA共转染，或通过样品处理激活反式作用因子。该蛋白可能是一种转录因子，与报告基因上游克隆的感兴趣启动子区域结合。例如，当HIV-1中的转激活蛋白tat蛋白从转染细胞中的一个载体表达时，与报告基因相关的不同HIV-1长端重复(LTR)序列的活性增加，表现为报告基因蛋白活性的相应增加。

除了评估启动子活性外，报告子通常用于研究非翻译区域(UTRs)对mRNA稳定性、蛋白质定位和翻译效率的影响。例如，可以在报告基因的下游或3´插入microRNA (miRNA)靶位点，以研究microRNA如何影响RNA稳定性。

如何测量报告基因的活性?

报告基因或更确切地说，从报告基因序列翻译的蛋白质可以通过检测酶活性或分光光度特征来分析，或间接地通过基于抗体的分析来分析。一般来说，酶的分析是更敏感的，因为需要少量的报告酶产生可检测水平的反应产物。leyu乐鱼网如果细胞中存在内源性酶活性(例如，β-半乳糖苷酶分解乳糖)，酶分析的一个潜在限制是高背景。基于抗体的分析通常不太敏感，但将检测报告蛋白是否具有酶活性。

从根本上说，报告分析使用蛋白质来测量生物结果，使用可观察的参数，如生物发光。

光子主要是通过化学发光和荧光产生的，这是从激发态分子轨道到低能量轨道的能量跃迁的结果。然而，激发态轨道的形成方式不同。在化学发光中，激发态是放热化学反应的产物，而在荧光中，激发态是由光吸收产生的。

激发态产生的这种差异极大地影响了分析特性。例如，基于荧光的分析往往更亮，因为高强度的光可以用来产生激发态。在化学发光实验中，化学反应通常产生较低的光子发射率。更大的荧光亮度似乎与更好的分析灵敏度相关，但通常情况下并非如此。测定灵敏度是通过对信号相对于背景的统计分析来确定的，其中相对信号由样品测量减去背景测量组成。荧光分析往往有更高的背景，导致较低的相对信号。

荧光分析中较高的背景主要是因为荧光计不能完美地区分进入样品的大量光子和来自分析荧光团的更小的光子发射。这种区分主要是通过光学过滤(发射光子的波长比激发光子长)和几何原理来完成的，因为发射光子的路径通常与激发光子不同。然而，光学滤光片在区分波长的能力上并不完美，光子可以通过散射改变方向。化学发光的优点是，由于光子不需要产生激发态，当测量样品的光子流出时，它们不构成固有的背景。由此产生的低背景可以精确测量光线的微小变化。

了解更多关于生物发光的优势这篇文章．

生物发光是生物体自身发光的一种自然现象。生物发光的基础是荧光素酶与发光底物(如荧光素)相互作用产生光(图1)。使用最广泛的荧光素酶是甲虫荧光素酶(包括萤火虫荧光素酶)，Renilla荧光素酶和改良的深海虾荧光素酶(NanoLuc®荧光素酶)。荧光素酶基因已经从细菌、甲虫(如萤火虫)、Renilla、深海虾(Oplophorus)，Aequorea，Vargula而且Gonyaulax(腰鞭毛虫)。其中，只有细菌，甲虫，深海虾和Renilla已发现一般用作报告基因，以评估转录表达。这里我们描述常用的荧光素酶报告基因。

生物发光检测分析的基础是利用酶及其底物的高效发光化学，用于分析方法。通过保持每个反应组分的浓度恒定，除了一个组分随所研究的过程而变化外，所产生的光与可变组分成正比。这将一个可观察参数与反应结果结合起来。在使用荧光素酶的测定中，可变组分可能是荧光素酶本身、其底物或辅因子。由于生物发光的背景非常低，比例线性范围可以是巨大的，通常延伸10⁴-至10⁸-fold除以可变组分的浓度。

细胞内荧光素酶通常通过添加含有洗涤剂的缓冲溶液溶解细胞和荧光素酶底物来启动发光反应来定量。发光缓慢衰减，信号随着时间的推移而降低。为了使萤火虫和Renilla荧光素酶测定在较长时间内(从几分钟到几小时)保持稳定的发光，需要对发光反应进行不同程度的抑制。即使在这种情况下，也只有10个^-20年可以定量每个样品中荧光素酶的摩尔数或更少的摩尔数。这相当于每个细胞大约有10个分子。

相比之下，NanoLuc®荧光素酶具有固有的更长的信号半衰期。基于NanoLuc®的测定，使用新型呋喃嗪底物来测量NanoLuc®荧光素酶活性，显示出更亮的信号和更慢的发光衰减速率，信号半衰期约为120分钟。这些延长的半衰期分析为报告基因的应用提供了方便。只需添加试剂，并测量结果的发光。

大多数报告基因检测涉及一个或两个报告基因。大多数情况下，第二个报告器由“控制”向量表示，以规范化实验报告器的结果。例如，第二个报告器可以控制细胞数量或转染效率的变化。通常，对照报告基因由组成型启动子驱动，控制载体与“实验”载体共转染。不同的报告基因用于控制和实验载体，以便两个报告产物的相对活性可以单独测定。leyu乐鱼网下面的“报告基因分析简介”动画演示了使用双荧光素酶®报告分析系统作为研究启动子结构、基因调控和信号通路的报告分析的基本设计。

或者，您可以设计双报告基因分析，其中两个报告基因都用作实验报告基因。这样的双报告分析对于在一次实验中有效地提取更多信息特别有用。有关在双荧光素酶测定中使用一个或两个实验报告器的更多信息，请阅读文章如何选择NanoDLR™双报告分析格式．

以下部分提供了关于特定生物发光报告分析的信息，帮助您选择适合您的研究需要的报告基因和分析方法。表1，2而且3.总结可用的荧光素酶基因、测定方法和试剂。

记者化验

基于单个报告器的分析提供了从细胞中获取基因表达数据的最快方法。然而，由于细胞本质上是复杂的，从单一报告实验中收集的信息可能不足以获得详细和准确的结果。因此，在选择报告方法学时，首先要考虑的问题之一是决定来自单个报告方法学的信息是否足够，或者是否可以从第二个报告方法学收集到的附加信息中获益(例如，转染效率或细胞数量差异的归一化)。如果需要更多信息，请参阅下面涉及双报告器分析的部分。

当选择荧光素酶测定法时，在发光强度和持续时间之间的权衡往往是必要的，因为明亮的反应消退相对较快。用萤火虫或Renilla荧光素酶测定产生最大的发光导致更高的灵敏度，但使用具有更长的信号半衰期和更稳定的发光信号的测定在多孔板中进行分析时更方便。在延长半衰期的萤火虫荧光素酶测定中，有ONE-Glo™荧光素酶检测系统(猫。# E6110)和ONE-Glo™EX荧光素酶检测系统(猫。# E8110)。ONE-Glo™荧光素酶检测系统产生最大的发光强度，具有45分钟的半衰期，并且更能耐受非最佳反应条件。ONE-Glo™EX试剂具有较长的信号半衰期(约2小时)，一旦重建，在4°C或室温下更稳定，在细胞培养基中显示出较少的酚红干扰，比其他荧光素酶测定试剂具有较少的气味。

的Steady-Glo®荧光素酶检测系统提供更长的发光持续时间，但较低的强度。Steady-Glo试剂直接添加到哺乳动物细胞的培养基中，因此不需要事先裂解细胞。这允许你在多孔板中培养细胞，然后在一个步骤中测量报告基因的表达。Renilla荧光素酶测定具有不同的信号强度和半衰期也可用。

NanoLuc®荧光素酶不太需要为信号半衰期而牺牲发光强度。的Nano-Glo®荧光素酶检测系统(猫。# N1110)提供了一种简单的单次添加试剂，在常用的组织培养基中产生半衰期约120分钟的发光型信号。该试剂包含一个完整的裂解缓冲液，可直接用于表达NanoLuc®荧光素酶的细胞，但也与含有分泌荧光素酶的培养基兼容。

Dual-Reporter化验

在一次测定中测量两个报告酶被称为双报告酶测定，如果两个报告酶都是荧光素酶，则称为双荧光素酶测定。虽然最常用的双报告酶测定法同时测量萤火虫和Renilla荧光素酶活性，但下一代双荧光素酶测定法使用NanoLuc和萤火虫荧光素酶。这些荧光素酶对使用不同的底物，因此可以通过它们的酶特异性来区分。执行大多数双荧光素酶分析包括向每个样品添加两种试剂，并在每次添加后测量发光。添加第一试剂激活第一荧光素酶报告反应;添加第二试剂熄灭第一荧光素酶报告活性，并启动第二荧光素酶反应。

的Nano-Glo®双荧光素酶报告系统(猫。# N1610)测量萤火虫和NanoLuc®荧光素酶活性。这种报告和检测方法的组合具有几个优点，包括由于更好地猝灭萤火虫荧光素酶活性而降低的背景水平，以及由于更亮的NanoLuc®发光而提高的灵敏度。长信号半衰期(萤火虫荧光素酶和NanoLuc®荧光素酶约2小时)使该方法特别适用于高通量筛选。此外，较低的萤火虫荧光素酶背景和更亮的NanoLuc®信号允许更大的灵活性在分析配置。NanoLuc®或萤火虫荧光素酶均可作为实验报告基因，另一种荧光素酶可作为归一化对照，或两种报告基因均可作为实验报告基因，为您提供来自一组分析的更多信息。

较老的技术双报告法是双荧光素酶报告系统(猫。# E1910)，测量萤火虫和Renilla荧光素酶的活性顺序从单个样本。该系统需要在进行分析之前进行细胞裂解，并需要使用带有多孔板的试剂注入器。

的Dual-Glo®荧光素酶检测系统也测量萤火虫和Renilla荧光素酶活性来自单一样品，并提供较长的荧光素酶信号半衰期，这是有用的，当执行报告分析在多孔板。与其他设计用于多孔板的试剂一样，Dual-Glo®检测方法直接在哺乳动物细胞培养基中工作，无需事先裂解细胞。

一般来说，双报告者分析通过以下方法提高实验的准确性和效率:i)减少可能掩盖有意义相关性的可变性;Ii)规范实验系统中可能固有的干扰现象;iii)归一化样品间转染效率的差异。此外，在高通量筛选中，双报告蛋白检测可以减少由于化合物与报告蛋白直接相互作用而导致的非相关命中数(即“假”命中)。使用共发报告酶-具有不同化合物干扰谱的报告酶-可以帮助区分调节感兴趣的生物途径的化合物与影响报告酶稳定性或活性的化合物。

减少可变性

由于细胞是复杂的微环境，在实验中的样品之间以及在不同时间进行的实验之间可能会发生显著的变化。挑战包括保持样品之间均匀的细胞密度和活力，以及完成外源DNA的可重复性转染。多孔板的使用引入了一些变量，如边缘效应，这是由板上热分布和湿度的差异引起的。双报告者测定法可以控制这种变异性的大部分，从而在样品之间进行更准确和有意义的比较(Hawkins等．2002;汉娜et al。1998;木,1998;Faridiet al。2003）.

Live-Cell基质

研究人员努力监测细胞活动，尽量减少对细胞的影响。大多数报告酶活性测定使用终点裂解方法来破坏细胞，以便可以仔细控制报告酶周围的环境。然而，使用非溶性测定法来测量报告基因活性有其优点，包括随着时间的推移持续监测表达变化和与评估细胞健康的测定法进行多路复用。Promega科学家开发了多种活细胞底物，在不干扰细胞的情况下监测荧光素酶活性。

只需向培养基中添加一种试剂，NanoLuc®荧光素酶活性可监测数小时甚至数天。的Nano-Glo活细胞检测系统可以监测记者的活动长达2小时与最大的光强度。对于较长的时间，Nano-Glo®Vivazine™活细胞基质可以监测NanoLuc®活动超过几个小时，但光强度降低，而Nano-Glo®Endurazine™活细胞基质在连续几天监测报告活性方面具有最大的信号稳定性，但在NanoLuc®衬底中信号强度最低。这些活细胞检测试剂可以为研究蛋白质相互作用和简化时间过程研究提供报告基因表达的动力学测量。
Renilla荧光素酶只需要氧气和腔肠嗪就能产生发光，提供了一个简单的荧光素酶系统来测量活细胞的发光。的EnduRen™而且ViviRen™活细胞底物克服了腔肠嗪在水溶液中的不稳定性，容易在活细胞表达时产生发光Renilla荧光素酶。因为细胞仍然是活的，你可以用另一种方法通过多路复用来确定活细胞的数量。

活细胞底物的替代品是报告蛋白的分泌形式，可通过测量细胞培养基中的报告蛋白活性来定量。NanoLuc®荧光素酶融合n端分泌信号提供保密表单(secNluc)，在报告分析之前或期间不需要细胞裂解。

报告化验资源乐鱼体育是什么

• 记者分析:
  使用NanoLuc®Luciferase和GloMax®Discover系统检测生理水平的HIF1α表达
• Dual-Reporter化验:
  选择荧光素酶报告试剂:比较指南
  设计一种生物发光报告实验:选择你的实验报告
  生物发光报告实验的设计:归一化
  使用NanoDLR™双荧光素酶检测系统混合和匹配主报告和对照报告

报告基因的传统用途主要是分析基因表达和解析顺式作用遗传元件的功能，如启动子和增强子(所谓的“启动子撞击”)。在典型的实验中，缺失或突变发生在启动子区域，它们对报告基因偶联表达的影响是定量的。然而，报告基因也可用于研究其他细胞事件，包括与基因表达无关的事件，如细胞健康和信号通路。有关更多信息，请查看以下介绍生物发光实验动画。

正常化细胞生理变化

与细胞生理相关的事件可以影响报告基因的表达。特别值得关注的是细胞毒性的影响，当使用单报告试验时，细胞毒性可以模拟基因下调。报告分析，可以与细胞活力或细胞毒性试验相结合，以独立监测报告表达和细胞活力，以避免数据误解(Farfan等．2004)。多路分析的使用允许细胞内事件的相关性，如RNAi靶抑制的耦合，对细胞生理学的后果(Hiroseet al。2002)。

发光细胞活力或细胞毒性测定，如CellTiter-Glo®2.0细胞活力检测(猫。# G9241)和CytoTox-Glo™细胞毒性检测(猫。# G9290)，使用稳定的萤火虫荧光素酶产生发光信号，表明细胞健康。因为这些测定法含有萤火虫荧光素酶，它们不能直接与萤火虫荧光素酶报告试验相结合。然而，该检测方法可以很容易地与非破坏性荧光素酶检测相结合。例如，通过向培养基中添加一种Nano-Glo®活细胞基质并测量发光来定量NanoLuc®荧光素酶的表达。当报告测量完成后，将CellTiter-Glo®2.0或CytoTox-Glo™试剂添加到样品中以灭活NanoLuc®荧光素酶并启动发光以评估细胞活力。或者使用Nano-Glo®荧光素酶检测系统从不同的培养基中测量分泌的NanoLuc®报告细胞的活性。

或者，您可以将发光报告试验与荧光细胞活力和细胞毒性试验结合使用，以监测细胞健康并使单报告试验结果规范化。例如，CellTiter-Fluor™细胞活力检测(猫。# G6080)是一种非溶性荧光测定方法，可测量种群中活细胞的相对数量。的CellTox™绿色细胞毒性检测(猫。# G8741)使用一种专有染料，这种染料不来自活细胞，但优先与死细胞的DNA结合。当DNA结合时，染料的荧光显著增强，所产生的荧光与细胞毒性水平成正比。这些细胞健康检测非常适合与均相荧光素酶检测试剂进行多路复用，如Bright-Glo™，Steady-Glo®和ONE-Glo™荧光素酶检测系统(Zakowicz等．2008年),Renilla-Glo®荧光素酶检测系统以及纳米glo活细胞基质。

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• 文章:通过检测多路复用使您的基因报告数据有意义

监测RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种与目标mRNA互补的双链RNA通过刺激目标mRNA的降解特异性地使基因失活的现象。因此，RNAi或更普遍的RNA沉默已经成为分析基因功能的强大工具。

生物发光报告器已被用于研究RNAi。例如，pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体(猫。# E1330)基于双荧光素酶技术，以萤火虫荧光素酶作为主要报告细胞来监测mRNA的调控和Renilla荧光素酶作为标准化的对照报告。pmirGLO载体通过插入萤火虫荧光素酶基因下游或3´的miRNA靶点，定量评估microRNA (miRNA)活性。萤火虫荧光素酶表达的减少表明内源性或引入的miRNA与克隆的miRNA目标序列结合。

评估细胞信号通路

荧光素酶报告分析被广泛用于研究细胞信号通路，并作为药物发现的高通量筛选工具(Brasier等．1992年,壮族等．2006)。具有克隆调控元件指导报告基因表达的合成物可用于监测信号转导和识别所涉及的信号通路。通过将荧光素酶表达与报告结构中的特定反应元件(REs)联系起来，用该结构转染细胞，添加特定的处理，然后测量报告活性，研究人员可以确定使用哪些REs，从而确定涉及哪些信号通路。抑制剂和siRNAs的使用可以用来确认哪些因素参与了这种反应。

有各种各样的萤火虫荧光素酶pGL4载体，您可以选择许多响应元件和调节序列，用于表征和调节信号通路。例如，CREB, CRE和STAT5RE可用于您的研究。看到表1一个完整的列表。许多这些载体编码湿霉素抗性基因，以允许选择稳定转染的细胞系。

检查核受体

生物发光报告基因还可以表征核受体，这是一类配体调节的转录因子，可以感知细胞内类固醇和其他分子的存在。核受体通常存在于细胞质中，通常与相关的调控蛋白复合物。配体结合触发转位进入细胞核，其中受体通过dna结合域结合特定的反应元件，导致邻近基因的上调。生物发光报告可以利用一种通用的受体检测来识别和表征核受体激动剂、拮抗剂、辅抑制剂和辅激活剂。通用核报告检测可被认为是一种“单杂交”检测，其中核受体的配体结合域(LBD)与酵母GAL4转录因子融合，当配体与核受体结合时，萤火虫荧光素酶表达(图8)。