如何选择细胞活力或细胞毒性试验

细胞活力测定使用多种标志物作为代谢活性(活)细胞的指标。常用的标记的例子包括测量ATP水平，测量还原底物的能力，以及检测活细胞特有的酶/蛋白酶活性。

实时细胞活力分析

的RealTime-Glo™MT细胞活力测定(猫。# G9711)实时测量细胞活力。在本实验中，工程的荧光素酶和原底物(不是荧光素酶的底物)被直接添加到培养基中。原底物可以穿透细胞膜进入细胞(图1)。然而，只有代谢活跃的活细胞才能将原底物还原为荧光素酶的底物。然后，所述底物离开所述细胞，在该细胞中被检测试剂中的荧光素酶使用以产生发光信号。同一口井可重复测量3天。这种方法的主要优点是它允许简单的动力学监测，以确定剂量反应使用较少的板和细胞。此外，由于该方法不需要细胞裂解，相同的细胞可以用于其他基于细胞的分析或下游应用。

ATP细胞活力测定

ATP可以用来测量细胞活力，因为只有活细胞才能合成ATP。ATP可以用CellTiter-Glo^®发光细胞活力测定(猫。# G7570)，试剂含有洗涤剂，稳定的荧光素酶和荧光素底物。洗涤剂溶解活细胞，将ATP释放到培养基中。在ATP存在的情况下，荧光素酶利用荧光素产生发光，可以在10分钟内用发光计检测到(图2)CellTiter-Glo^®2.0试验(猫。# G9241)作为单一溶液提供，减少试剂制备时间，并提供室温存储的便利，便于实施。这些ATP分析比其他方法更快，因为它们不需要很长的孵育时间来将底物转化为有颜色的产品。它们还具有出色的灵敏度和宽线性，使它们与使用低细胞数的高通量应用程序高度兼容。与其他方法相比，它们也不容易产生伪影。

活细胞蛋白酶活力测定

活细胞蛋白酶活性在细胞死亡后迅速消失，因此它是活细胞的有用标记。使用CellTiter-Fluor™细胞活力检测(猫。# G6080)，活细胞蛋白酶活性可以使用细胞渗透性荧光蛋白酶底物(GF-AFC)来测量。底物进入活细胞，被活细胞蛋白酶裂解，产生与活细胞数量成比例的荧光信号(图3)。该方法的孵育时间为0.5-1小时，比四唑测定法(1-4小时)短。由于这种方法不裂解细胞，它允许在相同的样品孔中与许多其他分析进行多路复用，包括基于生物发光报告细胞的分析。

四氮唑还原细胞活力测定

用于检测活细胞的四唑化合物分为两类:

可轻易穿透活细胞的正电荷化合物(MTT):

代谢活跃的活细胞能够将MTT转化为紫色的甲马赞产物。因此，颜色的形成可以成为活细胞的有用标记。的CellTiter 96^®非放射性细胞增殖试验(MTT)(猫。# G4000)使用这种化学反应。但这种方法的孵育时间较长(通常为4小时)。此外，甲醛产品是不溶的，所以在记录吸光度读数之前必须添加增溶试剂。

不能穿透细胞的负电荷化合物(MTS, XTT, WST-1):

当使用CellTiter 96^®水溶液细胞增殖试验(MTS)(猫。# G3582)，带负电荷的化合物必须与中间电子偶联试剂结合，它们可以进入细胞，被还原，然后离开细胞，将四唑转化为可溶性的甲醛产物。本方法孵育时间为1-4小时。由于所得的甲醛是可溶的，因此不需要添加增溶剂，使其更加方便。

Resazurin还原细胞活力测定

Resazurin是一种可渗透细胞的指示染料，颜色为深蓝色，具有很少的内在荧光。的CellTiter-Blue^®细胞活力测定(猫。# G8080)使用resazurin来测量细胞活力。只有代谢活跃的活细胞才能将再青嘌呤还原为再青嘌呤，再青嘌呤呈粉红色，呈荧光状。在孵育1-4小时后，用微孔板分光光度计或荧光计定量信号。这种方法相对便宜，比四氮唑测定法更灵敏。然而，被测化合物的荧光可能会干扰再吸收红素的读数。

所有四唑或再青嘌呤还原测定法的一个缺点是，它们依赖于着色产物或荧光产物随时间的积累。leyu乐鱼网由于信号随着时间的推移逐渐增加，在这种长时间的孵育期间，细胞活力的下降是检测不到的。

细胞死亡后发生的主要事件之一是膜完整性的丧失，这使得化学物质或蛋白质可以自由地进入或离开细胞。在这里，我们介绍了细胞毒性试验，通过检测某些蛋白质(死细胞蛋白酶，乳酸脱氢酶)的流出或化学物质(DNA染料)的流入来评估死细胞的存在。

死细胞蛋白酶释放细胞毒性试验

当细胞死亡并失去膜的完整性时，就会释放死细胞蛋白酶。发光衬底(CytoTox-Glo™细胞毒性检测,猫。# G9290)或荧光底物(CytoTox-Fluor™细胞毒性试验,猫。# G9260)可用于测量死细胞蛋白酶活性(图4)。由于底物不具有细胞渗透性，因此完整的活细胞基本上不会产生来自该底物的信号。此外，由于分析是非溶性的，他们可以多路复用与其他兼容的化验化学物质。

乳酸脱氢酶(LDH)释放细胞毒性试验

失去膜完整性的死亡细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)，它催化乳酸转化为丙酮酸，同时产生NADH。释放的LDH活性可以通过提供过量底物(乳酸盐和NAD+)来产生NADH来测量。这种NADH可以用不同的化学方法测量:

1.LDH-Glo™细胞毒性试验

在LDH-Glo™细胞毒性试验(猫。# J2380)，还原酶利用NADH和还原酶底物(原荧光素)生成荧光素。荧光素使用专有的荧光素酶测量，光信号与LDH的量成正比，由光度计测量。

2.CytoTox-ONE™均质膜完整性检测

的CytoTox-ONE™均质膜完整性检测(猫。# G7890):利用荧光计测量，将再青嘌呤转化为荧光再青嘌呤产品。

3.CytoTox 96®非放射性细胞毒性试验

的CytoTox 96^®非放射性细胞毒性试验(猫。# G1780)检测四唑盐(INT)转化为红色甲马赞产品，通过颜色吸光度测量

DNA染料细胞毒性测定

一些DNA结合染料被活细胞排除在外，但可以进入并染色可渗透的死细胞的DNA。常规染料，如台盼蓝，通常需要使用血细胞计手动计数染色细胞，这是劳动密集型的，而且不容易扩展。传统染料的另一个缺点是它们可能对细胞有毒，只能用于终点测量。

较新的染料，如CellTox™绿色染料，在与DNA结合时产生荧光信号，使用荧光计很容易测量。它可以在培养基中稀释，并在播种或用测试化合物处理时直接输送到细胞中，从而实现实时动力学测量。的CellTox™绿色细胞毒性检测(猫。# G8741)无毒，高度光稳定性和易于扩展。

选择细胞健康检测方法是一项具有挑战性的任务。在这里，我们提供了一系列因素考虑时，选择细胞为基础的分析手动或自动系统。

你想测量什么?

在实验结束时，你想检测哪些细胞，是活的还是死的?可用的细胞健康测定法可专门检测活细胞的数量(活力测定法)、死亡细胞的数量(细胞毒性测定法)和用于评估细胞死亡的机制(凋亡测定法)。如果所寻求的信息只是为了确认实验井的“无处理”阴性对照和“毒素处理”之间是否存在差异，那么在测量活细胞数量或死亡细胞数量之间的选择可能是无关的。然而，如果正在寻求关于细胞死亡机制的更详细信息，则暴露于毒素的持续时间、测试化合物的浓度和测定终点的选择就变得至关重要(1)。探索以下考虑因素，以帮助您确定想要测量的内容以及可以帮助您的测定方法。

你们的模型系统是什么?

细胞健康研究中使用的起源物种和细胞类型通常由特定的项目目标或正在研究的药物靶标决定。无论选择哪种模型系统，建立一个一致的和可重复的程序培养细胞和建立检测板是很重要的。在进行测定之前，每个孔的细胞数量或平衡期的变化可能会影响细胞生理学。培养过程中每个步骤的维护和处理都应标准化并验证一致性。此外，在整个实验过程中，一定要使用已知的阳性和阴性对照，以建立对细胞生理状况的一般了解。因为样本的性质取决于细胞类型以及它是2D还是3D培养模型，每个培养模型系统的测定程序都应进行验证．需要使用较少细胞数量的模型系统，如原代细胞或其他有限细胞类型，将需要具有更高灵敏度的测定。

你用的是2D细胞培养还是3D细胞培养?

培养中的细胞只是一个模型系统，与正常体内环境中的细胞不同。许多研究人员现在正在使用3D细胞培养来更接近地模拟体内条件。3D培养中的细胞不是在平板表面单层生长，而是在一种构象中生长，这种构象允许它们彼此相互作用，形成细胞连接。当进行基于细胞的分析时，这种增加的复杂性可能会给实验设计带来挑战，因为分析试剂可能难以到达大型微组织的中心，而溶解分析可能无法破坏3D系统中的所有细胞。化验可能需要为3D系统优化通过用更强的洗涤剂重新配制试剂，并结合机械破坏和更长的孵育时间。比色法，如MTT，不是用于3D细胞培养的最佳方法，因为它们穿透多层细胞的能力有限。

的CellTiter-Glo^®三维细胞活力测定(猫。# G9681)是专门设计用于确定3D培养模型中的细胞活力。与其他测定方法相比，分析试剂增加了溶解能力，允许更好地渗透大球体样品，从而更准确地测定活力。的CellTiter-Glo^®3D分析试剂测量ATP作为活力指标，并产生比比色法或基于荧光的方法更敏感的发光读数。

测定化合物的细胞毒性LDH-Glo™细胞毒性试验(猫。# J2380)非常适合与3D培养模型一起使用。该方法不依赖于穿透细胞膜，而是测量死亡细胞向培养基中释放的LDH。该方法只需要去除小体积的介质(2-5 μ l)，允许随着时间的推移重复采样。这样可以保存微组织并保持剩余的活细胞，允许您使用样品进行其他分析，或用于核酸分析，以使用相同的样品获得更多的数据。leyu体育靠谱吗

什么时候进行细胞健康检测合适?

将检测到的检测标记与您需要的信息相匹配对于选择合适的细胞健康检测是至关重要的。对不同细胞死亡机制中发生的变化有基本的了解将有助于您决定选择哪种测定方法。图9显示了一个简化的例子，说明了在细胞凋亡和坏死过程中发生的时间变化，以及使用测量不同标记物的测定所预期的结果。

体外培养的正在发生凋亡的细胞最终会发生继发性坏死。经过长时间的孵育，凋亡细胞最终停止代谢，激活caspases，将磷脂酰丝氨酸(PS)翻转到外膜，失去膜的完整性，并将其细胞质内容物释放到培养基中。细胞凋亡的标志物，如caspase活性或细胞表面PS暴露，可能只是短暂的存在。因此，要确定细胞死亡的主要机制，了解模型系统中细胞死亡过程的动力学是至关重要的。为了避免错过一个关键的时间点，你可能想要选择非溶性实时分析，如RealTime-Glo™Annexin V细胞凋亡和坏死检测(Cat.#JA1011)，允许在一段时间内从单个检测中重复读取。

是否需要从多个时间点收集数据?

活细胞动力学分析是检测试剂，允许相同的样品在多个时间点重复测量。这将节省您的时间和精力，使您能够实时收集更丰富的数据。如果您需要进行时间和剂量反应实验，以确定药物的起始或毒性机制，您可能会受益于实时分析。特别是当你使用有限的或珍贵的细胞样本时，从你的样本中获得尽可能多的数据是至关重要的。Promega提供了测定方法组合能够活细胞动力学细胞健康测定。

的RealTime-Glo™MT细胞活力测定(猫。# G9711)允许您根据细胞数量在同一样品中持续监测细胞活力长达72小时。该方法可测定活细胞的还原潜能，且不依赖于atp，为活细胞测定提供了一种正交方法。的RealTime-Glo™Annexin V细胞凋亡和坏死检测(猫。# JA1011)是一种基于平板阅读器的方法，用于测量细胞凋亡过程中细胞膜外小叶上磷脂酰丝氨酸(PS)的实时暴露。发光(凋亡)和荧光(坏死)信号的组合和时间用于区分继发性坏死与其他细胞毒性事件引起的坏死。的CellTox™绿色细胞毒性检测(猫。# G8741)使用一种染料，当与膜受损细胞中的DNA结合时产生荧光信号。该试验可直接应用于播种时的细胞或在任何孵育时间点用测试化合物处理时的细胞，允许实时动力学测量细胞毒性的开始。

由于这些分析无毒且不溶解，剩余的活细胞保持完整，用于额外的下游应用，从而在每个样品中获得更多数据。

你需要测试多少个样品?

如果只有一个或几个样本需要测量，人工计数活细胞或死细胞使用血细胞计可能是足够的。成像或流式细胞术方法也适用于低样本量，但不适用于高通量应用。如果要测量大量样品，不需要细胞清洗或离心步骤的均质分析是最有效的。此外，试剂制备和孵育所需的时间应尽量少。吸光度、荧光或发光信号的稳定性是另一个重要因素，它提供了记录数据的便利性和灵活性，并在处理大批量板时最大限度地减少变异性。为了筛选成千上万的样品，选择足够敏感的测定方法是有益的，可以将其缩小到高密度板格式(384孔或1536孔板)。

需要什么样的敏感度?

选择检测方法时要考虑的另一个因素是检测的敏感性。所需的灵敏度与每个样品使用的细胞数量密切相关。一般来说，发光分析比基于检测荧光或吸光度的分析更敏感，因为极小的背景发光导致高信噪比。通过荧光检测，来自细胞的固有荧光、复合荧光以及激发波长和发射波长之间的光谱重叠可以降低信噪比。

如果您选择测量代谢标志物，如ATP水平或MTS四唑还原，检测灵敏度将随细胞类型而变化。增加孵育时间可以提高某些测定的信号背景比。检测试剂的灵敏度取决于模型系统的两个参数，如平板格式和每孔的细胞数量;除了被评估的参数外，如细胞活力的降低。旨在检测10,000个细胞群体中活力变化的分析可能不需要最敏感的分析技术。例如，一个四氮唑实验，如CellTiter 96^®非放射性细胞增殖试验(猫。# G4000)可以很容易地检测出10,000和8,000个活细胞之间的差异。另一方面，在高密度多孔板格式中使用低细胞数量的分析模型系统可能需要最大的检测灵敏度，例如用CellTiter-Glo^®发光细胞活力测定(猫。# G7570)，可以很容易地检测不到100个细胞。

试剂的稳定性如何?

对于使用自动化高通量筛选平台的研究人员来说，试剂的稳定性和与机器人组件的兼容性通常是一个问题。检测试剂必须在环境温度下稳定一段时间，以完成分配到多个板。此外，测定所产生的信号应在较长时间内保持稳定，以便在连续或批处理模式下灵活地记录数据。CellTiter-Glo®2.0细胞活力测定试剂盒的配方允许在环境温度下存储多天，并产生稳定的发光信号，其半衰期使批量处理成为可能。

你需要什么仪器?

使用哪些盘子比较合适?

当使用我们的平板分析时，选择正确的平板类型取决于您的研究需求。如果需要对细胞进行显微镜观察，则需要不透明的透明底板。

一般来说，不透明的黑色板用于荧光分析的还原背景，不透明的白色板用于发光分析的最佳光输出。然而，来自大多数发光分析的信号强度是足够的，这样黑色板可以使用。使用黑色板进行发光分析为同一样品的荧光和发光分析提供了最大的灵活性。透明板可用于比色分析，但不应用于荧光或发光分析。选择正确的仪器和盘子可以帮助你减少串扰以及其他可能混淆数据的问题。

你想对你的样品进行多次化验吗(多重化验)?

多路复用多个检测方法是一种通用的方法，可以从单个样品中提供更多信息。例如，您可以在同一样品孔中同时测量细胞应激反应通路事件和细胞死亡机制，或者使用报告反应测量细胞活力，以将结果归一化到活细胞数量。多路复用要求所使用的检测化学物质的兼容性，以及使用不同的检测波长或检测不同的模式(如荧光和发光)来区分单独信号的能力。对于兼容的化验化学，多路复用可以在同一样品孔中同时完成。对于某些化验组合，必须以连续的方式进行测量。还可以通过将部分样品分离到不同的容器中来实现其他多路复用选项，以克服化验化学不兼容性、仪器要求或板格式(例如，透明塑料vs.不透明塑料)。例如，LDH-Glo™细胞毒性试验(猫。# J2380)提供了收集多个数据点的机会，通过将小等分的培养上清移到白色不透明的检测板中，从而使含有细胞的原始检测板可用于其他分析，如报告基因分析、图像分析、核酸分析等。leyu体育靠谱吗

样品井中的多路复用分析消除了不同分析需要多个并行样本的需要，可以节省您的时间、精力和成本，并与使用并行样本相比具有统计优势。我们的几种同质细胞毒性、凋亡和活力检测可以在不转移介质的情况下进行多重检测，允许研究人员在同一样品孔中检测多个参数。

多路复用协议示例:

• 使用CellTox™绿色细胞毒性分析解释多路传输数据
• 实时细胞活力测量介绍
• 在自动化平台上执行基于细胞的多路检测
• 多路复用均质细胞分析

该试验是否可重复?

在选择商业检测方法时，数据的可重复性是一个重要的考虑因素。然而，对于大多数基于细胞的测定，重复样品之间的差异更可能是由细胞而不是测定化学物质引起的。通过使用倾向于形成团块而不是单个细胞悬浮的细胞系，可以放大细胞电镀过程中的变化。培养皿中延长的孵育期和边缘效应也可能导致重复的重现性降低和不理想的Z ' -因子值(2)。在选择一种检测方法时，了解结果变异的原因是关键。

费用是多少?

通常在试剂的成本和测定的质量或它为用户提供的便利性之间存在权衡。成本较低的试剂通常具有更复杂的程序，灵敏度有限，或由于较长的培养时间和执行时间而对培养中的细胞产生毒性。尽管有这些普遍的缺点，但在许多应用中，成本较低的分析方法是合适的;然而，应注意避免使用具有细胞毒性的试剂，因为它们会影响检测结果或限制与其他检测的多重作用能力。

市售的质量控制试剂和检测试剂盒通常更昂贵，但从长远来看，通过避免重复实验或不可复制的结果，通常可以节省时间和成本。例如，尽管ATP细胞活力测定的试剂成本可能高于其他测定，但其速度(节省时间)、灵敏度(节省细胞样本)和准确性(数据可信度)可能超过初始成本。具有良好检测灵敏度的测定方法更容易缩小到384孔或1536孔格式，可以节省细胞培养试剂，并能够测试非常少量的昂贵或罕见的测试化合物和样品类型，特别是原代细胞。能够实时测量的测定方法还可以减少成本和节省时间，因为不需要为时间过程实验复制板。

有许多选项可以帮助您计划和设计您的细胞健康实验。选择细胞活力或细胞毒性试验可能是一项具有挑战性的任务，但我们有各种解决方案和资源来支持您的研究目标。乐鱼体育是什么要获得更多指导，请查看下面的相关资源。乐鱼体育是什么如果您需要更多信息，或需要帮助排除您的分析，我们经验丰富技术服务科学家都可以帮助你得到你需要的结果。

1.Riss, T.L.和Moravec, R.A.(2004)在基于细胞的细胞毒性试验中，使用多个测定终点来研究孵育时间、毒素剂量和电镀密度的影响。分析、药物开发技术。2(1), 51 - 62。

2.Zhang, J.H.， Chung, T.D.和Oldenburg, K.R.(1999)用于评估和验证高通量筛选测定的简单统计参数。J生物ol筛．4(2), 67 - 73。