转染

deae -葡聚糖是一种阳离子聚合物，是最早用于转染培养的哺乳动物细胞的化学试剂之一(Vaheri和Pagano, 1965;McCutchan和Pagano, 1968)。过量的正电荷，由DNA:聚合物复合体中的聚合物贡献，使复合体与带负电荷的细胞膜更紧密地结合。复合物的摄取大概是通过内吞作用。该方法成功地将核酸送入细胞进行瞬时表达;leyu体育靠谱吗也就是说，对于几天的短期表达研究。然而，deae -葡聚糖一般不适用于依赖于将转移的DNA整合到染色体的稳定或长期转染研究。其他合成的阳离子聚合物已被用于将DNA转移到细胞中，包括聚苯乙烯(Kawai和Nishizawa, 1984)，聚乙烯亚胺(Boussifet al。1995)和树状大分子(Haensler和Szoka, 1993;Kukowska-Latalloet al。1996)。

磷酸钙共沉淀作为转染方法在20世纪70年代初被引入(Graham and van der Eb, 1973)。这种方法仍然很受欢迎，因为成分容易获得，价格便宜，协议易于使用，对许多不同类型的培养细胞都有效。该方案包括将DNA与氯化钙混合，以可控的方式将这种混合物添加到缓冲盐水/磷酸盐溶液中，并在室温下培养混合物。控制的添加物产生沉淀，沉淀分散到培养的细胞上。沉淀被细胞通过内吞作用或吞噬作用吸收。磷酸钙转染通常用于各种细胞类型的瞬时和稳定转染。然而，磷酸钙共沉淀容易发生变异，不适合在体内基因转移到整个动物。此外，微小的pH变化(±0.1)会影响转染效率(Felgner, 1990)。

由于它们的缺点，化学试剂在很大程度上已经被合成脂基试剂所取代。

“脂质体”是指在水介质中形成胶体颗粒的脂质双分子层(Sessa和Weissmann, 1968)。人造脂质体在1980年首次被用于将DNA输送到细胞中(Fraleyet al。1980)。脂质体载体的下一个进展是合成阳离子脂质的发展(Felgneret al。1987)。脂类化合物的阳离子头基与核酸上带负电荷的磷酸盐结合。leyu体育靠谱吗脂质体介导的传递具有一些优势，如相对高效的基因转移，转染对磷酸钙或deae -葡聚糖具有抗性的特定细胞类型的能力，在体外和体内应用，从寡核苷酸到酵母人工染色体的所有大小的DNA的成功传递，RNA的传递和蛋白质的传递(在Kim和Eberwine, 2010;斯图尔特et al。2016)。脂质体技术转染的细胞可用于瞬时表达研究和依赖DNA整合到染色体或片段维持的长期实验。与deae -右旋糖酐或磷酸钙化学方法不同，脂质体介导的核酸传递可用于在体内将DNA和RNA转移到动物和人类(Felgnerleyu体育靠谱吗et al。1995）．

在生理pH值下具有整体净正电荷的脂质体是用于基因传递的脂质体中最常见的成分(图2)。通常，阳离子脂质体与中性脂质体混合，如L -二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE;图3)，可以增强基因转移能力。脂质分子的阳离子部分与带负电荷的核酸结合，导致脂质体/核酸复合体中的核酸压实(Kabanov和Kabanov, 1995;leyu体育靠谱吗Labat-Moleuret al。1996)。对于培养的细胞，脂质体/核酸复合物的整体净正电荷通常会导致更高的转移效率，大概是因为它允许复合物与带负电荷的细胞膜更紧密地结合。leyu体育靠谱吗脂质体复合体进入细胞可能通过脂质体的脂质部分内吞或与质膜融合发生(Gao和Huang, 1995)。在细胞内化之后，复合物出现在核内体中，随后出现在细胞核中。目前还不清楚核酸是如何从核内体和溶酶体中释放leyu体育靠谱吗并穿过核膜的。DOPE被认为是一种“融合性”脂质(Farhoodet al。1995年)，其作用可能是释放核内体中的这些复合物，以及促进外细胞膜与脂质体/核酸复合物的融合。leyu体育靠谱吗虽然转染的DNA需要进入细胞核，但细胞质是通过脂质体传递的RNA、蛋白质或反义寡核苷酸的作用位点。

Nonliposomal试剂

虽然脂质体转染试剂有广泛的应用，但它们可能不是对所有细胞类型都有效。非脂质体转染试剂可替代脂质体介导的转染方法。这类试剂包括能够与DNA或RNA形成复合物的聚合物，以及能在水溶液中形成胶束的其他类型的脂类。与脂质体转染试剂一样，它们具有低毒、可复制的结果和高效率，适用于各种类型的细胞。脂质纳米颗粒是这种转染方法的延伸，特别适合在临床研究和治疗应用中传递小分子药物(Cullis and Hope, 2017)。

非脂质体转染试剂的例子包括FuGENE®HD转染试剂(猫。# E2311)，适用于难以转染的细胞类型，FuGENE®6转染试剂(猫。# E2691)，适用于多种细胞系，高效、低毒。你应该根据经验为特定的细胞类型确定最佳的转染试剂和条件，因为细胞的固有特性影响任何特定转染方法的成功。

基因转移的物理方法始于20世纪80年代初。直接微量注射到培养的细胞或细胞核是一种有效但费力的技术，使用细针将核酸注入细胞(Cappechi, 1980)。leyu体育靠谱吗这种方法被广泛用于引入外来DNA非洲爪蟾蜍卵母细胞和果蝇胚胎。尽管相对低效，微注射仍然被用于将DNA转移到胚胎干细胞中，用于生产转基因生物(Bockampet al。2002)，特别是对农场动物的基因研究(Wall, 2001)。最近，微注射在基因编辑应用中重新流行起来。例如，它已被用于将CRISPR-Cas9 DNA交付到合子原核，以创建敲除猪(Chuanget al。2017)。

电穿孔首次被报道用于小鼠细胞的基因转移研究(Wong和Neumann, 1982)。其机制是基于使用电脉冲扰动细胞膜，形成瞬时孔，允许核酸通过进入细胞(Shigekawa和Dower, 1988)。leyu体育靠谱吗该技术需要优化每种类型电池的脉冲持续时间和强度。电穿孔通常比化学方法需要更多的细胞，因为它会导致大量的细胞死亡，而且通常需要大量的优化来平衡转染效率和细胞活力。现代仪器允许核酸运送到细胞核和成功转移DNA和RNA到原代细leyu体育靠谱吗胞和干细胞。在微流体装置中，电穿孔也与细胞的物理收缩相结合et al。2017)，用于高通量格式的快速基因表达。

另一种物理转染方法是生物粒子传递，也称为粒子轰击。这种方法依赖于通过膜穿透将核酸在微弹丸上高速递送到受体细胞leyu体育靠谱吗et al。1990)。它已被用于向培养细胞和体内细胞输送核酸(Kleinleyu体育靠谱吗et al。1987;霍尔德et al。1993;Oguraet al。2005)。最初，粒子轰击仪器的高成本阻碍了它们在研究中的应用，该方法主要用于农业遗传学。然而，最近纳米颗粒技术的发展开辟了新的应用领域。纳米粒子是一种合成材料，其中至少有一个粒子尺寸小于100nm。由于纳米颗粒体积小，可以高效穿过细胞膜，并通过共价或非共价相互作用与DNA和RNA结合(An and Jin, 2012)。这些特性已被用于培育转基因动物，作为原核微注射或病毒载体的替代方法(Dziegiel, 2016)。这种方法的一种变体是使用氧化铁纳米颗粒在强磁场存在的情况下进行基因传递，或称为“磁完美”(Dziegiel, 2016)。

选择稳定转染细胞

稳定转染的优化从成功的瞬时转染开始。然而，细胞应转染含有耐药基因的质粒，如新霉素磷酸转移酶(neo)．作为阴性对照，用不含耐药标记的DNA转染细胞。

1. 转染前，确定杀死非转染细胞所需的选择性药物浓度。
2. 转染48小时后，胰蛋白酶化贴壁细胞，并在含有适当选择药物的培养基中以不同稀释倍数(如1:100,1:500)进行复片。为了进行有效的选择，细胞应该是次融合的，因为融合的非生长细胞对G-418等抗生素的作用具有耐药性。
3. 在接下来的14天里，每3 - 4天更换一次含药物的培养基。
4. 在第二周，观察存活细胞的不同“岛屿”。耐药克隆可在2-5周内出现，取决于细胞类型。在转染阴性对照质粒的培养物中，细胞死亡应在3-9天后发生。
5. 通过标准技术(例如，使用克隆瓶)将单个克隆转移到96孔板上，并在含有适当药物的培养基中继续保持培养。

表4概述了用于选择和维持稳定转染物的常用抗生素。

表4。用于选择稳定转染物的抗生素。

计算稳定转染效率

以下程序可用于确定获得的稳定转染物的百分比。

请注意染色细胞在此过程后将无法存活。

所需的材料：

• 亚甲蓝
• 甲醇
• 冷去离子水
• 光学显微镜

1. 在合适的药物中选择大约14天后，在显微镜下监测培养物中存活细胞克隆的存在。当明显的存活细胞“岛”可见，非转染细胞已经死亡，继续步骤2。
2. 在50-70%甲醇中制备含有2%亚甲基蓝的染色剂。
3. 抽吸法将培养基从细胞中除去。
4. 向细胞中加入足够的染色剂以覆盖培养皿的底部。
5. 孵育5分钟。
6. 去除污渍，用去离子水轻轻冲洗。甩掉多余的水分。
7. 让盘子自然风干。这些平板可以在室温下储存。
8. 计数菌落数，根据细胞稀释度和原细胞数计算转染物百分比。

ViaFect™转染试剂

ViaFect™转染试剂(猫。# E4981)是一种新型配方，旨在高效、低毒地将DNA转染到多种细胞系中。ViaFect™转染试剂已被证明可以相对高效地转染传统上被认为难以转染的细胞系(如造血、原代和iPSC干细胞系)。该方案不需要去除血清或培养基，也不需要在引入试剂/DNA复合物后清洗细胞或更换培养基。此外，ViaFect™转染试剂不包含任何动物源性成分。

技术公报和手册

TM409ViaFect™转染试剂技术手册

Promega出版物

使用ViaFect™试剂最大化转染效率的替代协议

选择适合你细胞类型的转染试剂

FuGENE®HD转染试剂

FuGENE®HD转染试剂(猫。# E2311)是一种新型的非脂质体配方，可高效低毒地将DNA转染到多种细胞系中。该方案不需要去除血清(包括高达100%的血清)或培养基，也不需要在引入试剂:DNA复合物后清洗或更换培养基。此外，FuGENE®HD试剂支持在化学培养基中转染，不包含任何动物源性成分。有关FuGENE®HD转染试剂转染条件的更多信息，请访问转染助理．

技术公报和手册

TM328FuGENE®HD转染试剂技术手册

FuGENE®6转染试剂

FuGENE®6转染试剂(猫。# E2691)是一种非脂质体试剂，能高效、低毒地将DNA转染到多种细胞系中。该方案不需要去除血清或培养基，也不需要在引入试剂/DNA复合物后清洗或更换培养基。有关使用FuGENE®6转染试剂转染条件的更多信息，请访问转染助理．

技术公报和手册

TM350FuGENE®6转染试剂技术手册

Promega出版物

使用FuGENE®6和FuGENE®HD进行反向转染

优化培养细胞的转染

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