生化反应缓冲液

1966年，诺曼·古德(Norman Good)和同事们开始定义生化系统的最佳缓冲液(Good等．1966)。Good为这样的缓冲区设定了几个标准:

• 一个pK_一个6到8之间。大多数生化实验的最佳pH值在6-8之间。缓冲液的最佳缓冲范围是缓冲液弱酸组分的解离常数(pK_一个)加或减pH单位。
• 在水中的溶解性。生物反应在很大程度上发生在水环境中，因此缓冲液应该是水溶性的。
• 被生物膜排除。这对所有的生化反应并不重要。然而，如果这是你特定实验的一个重要标准，记住两性离子缓冲(分子内不同原子上的正电荷和负电荷)不通过生物膜是有帮助的。两性离子缓冲液的例子包括MOPS和HEPES;三酸盐和磷酸盐缓冲液不异构成两性离子。
• 盐的影响最小。换句话说，缓冲成分不应该相互作用或影响参与正在探索的生化反应的离子。
• 温度和浓度的变化对解离的影响最小。通常，随着浓度的变化，解离也会发生变化。如果这个变化很小，通常可以在不改变pH的情况下稀释原液。然而，对于某些缓冲液，浓度的变化对解离的影响更大，在不显著影响pH的情况下稀释原液。
  例如，Tris的pH值每稀释10倍就会降低约0.1个pH单位，如果稀释工作溶液，pH值可能会发生巨大变化，并且处于Tris的最佳缓冲范围的极限(20°C时的最佳缓冲范围pH值7.3-9.3)。注意，Tris不是Good的缓冲区之一。
  温度变化也是一个问题。随着温度的变化，Tris的离解发生了很大的变化。例如，如果你在4.0°C的pH值7.0下制备Tris缓冲液，并在37°C的相同缓冲液中进行反应，pH值将下降到5.95。
  如果你有一个Tris缓冲液，在20°C和pK_一个当pH值为8.3时，它将是许多生化反应的有效缓冲液(pH 7.3 - 9.3)，但同样的Tris缓冲液在4°C时由于其pK而在pH 7.3时成为较差的缓冲液_一个改为8.8。
  所以关键信息是:使缓冲液保持在你计划使用它的温度，如果你的实验涉及到温度的变化，选择一个缓冲范围，可以容纳任何变化的解离结果。
• 缓冲组分和关键反应组分之间的相互作用最小。如果在缓冲液和所需的辅因子(比如锌或镁等金属阳离子)之间形成复合物，反应也可能会受到影响。例如，在磷酸盐缓冲液中钙沉淀为磷酸钙。不仅任何Ca^{2 +}-要求反应受到影响，但磷酸盐缓冲液的缓冲能力也受到影响。
  在酶驱动反应的缓冲液中有过量的螯合剂可能会导致问题(例如，PCR扩增中高浓度的EDTA)。柠檬酸盐是一种钙螯合剂，所以在钙浓度非常关键的情况下避免使用柠檬酸盐缓冲液。
  Tris缓冲液再次给我们带来了问题，因为Tris含有一个活性胺基。如果你试图制造不含rnase的Tris缓冲液，Tris分子上的胺基将与二乙基焦碳酸酯(DEPC)发生反应，DEPC是一种通常用于预处理RNA工作水溶液的化学物质。所以，不要用含tris的depc处理溶液。HEPES是另一种与DEPC反应的缓冲物质。(还要记住，MOPS对于大多数RNA工作来说是一个更好的缓冲!)
  关键信息:缓冲区不是惰性的。小心你选择了哪一个。
• 化学稳定性。缓冲液应稳定，在工作条件下不击穿。它不应该被氧化或被它所使用的系统所影响。尽量避免含有反应参与者的缓冲液(例如，代谢物)。
  一些缓冲液，如MOPS，必须防止光线照射，但如果储存得当，它们在生化反应和RNA电泳等实验室协议中仍然是非常有用的缓冲液。
• 光吸收。缓冲液不应吸收波长可能用于光度实验读数的紫外光。
• 易于使用。缓冲成分应易于获取和制备。

好等．定义生化反应缓冲液的几个特性。无论选择哪种缓冲液，都需要考虑温度和环境对缓冲液的影响，并确保缓冲液与您的系统兼容。

如前所述，温度和浓度等因素会极大地影响pK_一个，因此，缓冲系统最有效的pH值范围。精心制备缓冲液对于实验的成功和可重复性是很重要的。

在适当的温度和浓度下准备缓冲液。

因为温度的变化可能与解离的变化有关，所以在你将要进行实验的温度下准备缓冲液。如果你的实验涉及到温度的变化，选择一个有pK的缓冲_一个这就容纳了它。

浓度的变化也可能与解离的变化有关，因此，如果您计划保持缓冲原液溶液，请确保在将原液稀释到所需浓度并在适当的温度下平衡后进行pH调整。或者，至少要检查稀释后的pH值。

正确调整缓冲系统的pH值。

许多缓冲材料是作为结晶酸或碱(例如，Tris碱)提供的。当这些材料溶解在水中时，溶液的pH值不接近pK_一个， pH值必须用合适的酸或碱调整，溶液才会成为合适的缓冲液。如果晶体缓冲材料是酸，那么pH值可以用碱调整到所需的pH值，而不会添加不需要的反离子。如果材料是碱，那么可以使用合适的酸。注意:将结晶酸或碱溶解在最终所需体积的60-70%，以便为你用来调整pH值的酸或碱的体积留出空间。在获得所需的pH值后，可以加入水以达到最终所需的体积。

然而，许多缓冲液不是通过溶解结晶酸或碱，然后调整pH使溶液接近pK_一个．相反，缓冲系统是通过将两种成分，如游离酸或碱和盐，以特定的比例混合来制备，以达到所需的pH值。例如，0.1M HEPES溶液和0.1M HEPES溶液，钠盐，可以混合以提供一系列0.1M HEPES缓冲液，pH值范围为6.55至8.55。通过混合柠檬酸和柠檬酸三钠，可以制成柠檬酸钠缓冲溶液并将其调节到所需的pH值。

其他缓冲液是通过使用Henderson-Hasselbalch计算将缓冲液组分与其共轭酸或碱混合制成的。例如，磷酸盐缓冲液是由单碱基和双碱基磷酸钠溶液按特定比例混合制成的。碳酸氢钠缓冲系统是由碳酸钠和碳酸氢钠混合溶液制成的。

正确使用pH计。

pH计的使用似乎几乎是直观的;然而，pH计必须正确维护，电极必须清洁和填充，pH校准缓冲液需要正确制备和无污染。当使用pH计时，温度很重要，因为pH计电极是依赖于温度的。测量pH值时，仪表应设置为环境温度。不幸的是，pH计通常是实验室中最被忽视的设备。随时准备一份pH计的制造商使用说明书，并确保每个实验室成员都了解如何使用和维护pH计。如果pH计被滥用，普通实验室缓冲液的pH值可能不正确，下游的后果可能是灾难性的。

准备缓冲液的技巧

• 使用前检查所有存储的缓冲区;如果它们看起来浑浊或变色，请不要使用。这些溶液可能有微生物污染，或者化学性质不稳定。一个例外是MOPS，有时会呈现微黄色。在检查污染迹象时，一定要旋转瓶子，因为污染物会沉淀到底部。
• 当创建一组实验室缓冲制备说明时，要完整，因为好的科学依赖于能够重复实验，如果缓冲不正确和一致，实验就不能重复。一定要包括所用材料的等级、来源等。说明使用的酸或碱和推荐浓度。此外，一定要说明在制备过程中进行pH值测量的时间点;如果要向缓冲区添加额外的组件，这一点尤其重要。
• 一些缓冲材料(如管道)不容易进入溶液，需要在微碱性或酸性环境中或加热才能溶解。
• 一些缓冲液(如MOPS和HEPES)不能高压灭菌，因为它们在加热时降解。
• 含有伯胺的缓冲液，如Tris和甘氨酸，会干扰Bradford染料结合蛋白测定(Stoll和Blanchard, 1990)。
• 在工作中接触酸和碱时，应穿戴防护服和防护眼镜。不要用强碱中和强酸，因为这会产生放热反应，例如，会融化你正在使用的容器。
• 如果出于某种原因你使用的溶剂不是水，一定要知道它是如何影响K的_一个你的缓冲剂。

以醋酸为例，弱酸、氢离子和共轭碱的平衡关系可以用数学表示为:

工厂吗?H⁺+一个^{- - - - - -}式中，醋酸解离的速率常数为k₁醋酸盐与氢离子的缔合速率常数为k₂．醋酸的解离率(-d [HAc]/dt)取决于解离速率常数和乙酸浓度，可写成:

- d [HAc]/dt＝k₁(HAc)

醋酸离子与氢离子结合生成乙酸的速率(d[HAc]/dt)亦取决于缔合速率常数(k₂)，以及乙酸和氢离子的浓度:

d (HAc) /dt＝k₂[H⁺] [^{- - - - - -}］

在平衡状态下，结合和解离的速率是相等的，所以

k₁(HAc) =k₂[H⁺] [^{- - - - - -}]或k₁/k₂= [H +] [^{- - - - - -}) / (HAc)

而且

K_一个(平衡常数)= [H⁺] [^{- - - - - -}) / (HAc),k₁/k₂= K_一个

我们可以用平衡常数和未解离的乙酸和乙酸离子来表示氢离子浓度。

[H⁺= k_一个((HAc) /^{- - - - - -}])

因为pH = -log [H⁺]和pK_一个定义为- logk_一个，我们可以将上面的平衡表达式转换为-log:

日志(H⁺= -log K_一个日志((HAc) /^{- - - - - -}])

取代，pH和pK_一个在适当的点:

pH = pK_一个日志((HAc) /^{- - - - - -}])

要更改-log的符号，请颠倒[HAc]/A^{- - - - - -}]：

pH = pK_一个+ log, n .日志^{- - - - - -}] /[哈哈])

就得到了Henderson-Hasselbalch方程。用这个方程，你可以计算酸碱浓度和pK时的pH值_一个是已知的。的pK_一个缓冲系统的pH值决定了缓冲最有效的pH值范围。

碳酸氢盐-碳酸盐缓冲液(pH 9.2-10.8)的制备

要创建100ml 0.1M碳酸氢钠缓冲溶液，混合碳酸氢钠和碳酸钠，十水，如下所示。

溶液A: 0.1M碳酸氢钠(NaHCO ._3.MW = 84.0) (MW =分子量)

方案B: 0.1M碳酸钠，十水(Na₂有限公司_3.•10 h₂O FW = 286.2) (FW =公式重量)

表1。Bicarbonate-Carbonate缓冲区。
pH值为20°C	pH值37°C	溶液A (ml)	溶液B (ml)
9.4	9.1	80	20.
9.5	9.4	70	30.
9.8	9.5	60	40
9.9	9.7	50	50
10.1	9.9	40	60
10.3	10.1	30.	70
10.5	10.3	20.	80
10.8	10.6	10	90

柠檬酸缓冲液(pH 3.0-6.2)的制备

要制作100ml 0.1M的柠檬酸缓冲液，将柠檬酸、一水和柠檬酸三钠脱水混合，如下所示。

溶液A: 0.1M柠檬酸一水(C₆H₈O₇•H₂O fw = 210.14)

溶液B: 0.1M柠檬酸三钠，二水合物C₆H₅O₇Na_3.•2 h₂O fw = 294.12)

表2。柠檬酸缓冲。
pH值	溶液A (ml)	溶液B (ml)
3．0	82.0	18.0
3.2	77.5	22.5
3.4	73.0	27.0
3.6	68.5	31.5
3.8	63.5	36.5
4.0	59.0	41.0
4.2	54.0	46.0
4.4	49.5	50.5
4.6	44.5	55.5
4.8	40.0	60.0
5．0	35.0	65.0
5.2	30.5	69.5
5.4	25.5	74.5
5.6	21.0	79.0
5.8	16.0	84.0
6．0	11.5	88.5
6.2	8．0	92.0

磷酸盐缓冲液的制备(25°C pH 5.8-8.0)

要制作100ml 0.1M磷酸盐缓冲液，将磷酸钠、二碱性二水钠和磷酸单碱性一水钠混合，如下所示，用水稀释至100ml。

注意:二碱性原液磷酸钠可能有点难溶解;增加一点热量可能会有所帮助。

溶液A: 0.2M磷酸钠，二氢二钠(Na₂HPO₄•2 h₂O fw = 178.05)

溶液B: 0.2M磷酸钠，单碱，一水(NaH₂阿宝₄•H₂O fw = 138.01)

表3。磷酸缓冲。
pH值25°C	溶液A (ml)	溶液B (ml)
5.8	4.0	46.0
6．0	6.15	43.85
6.2	9.25	40.75
6.4	13.25	36.75
6.6	18.75	31.25
6.8	24.5	25.5
7.0	30.5	19.5
7.2	36	14
7.4	40.5	9.5
7.6	43.5	6.5
7.8	45.75	4.25
8．0	47.35	2.65

附加缓冲和解的组成

1M HEPES (pH值7.5)

• 23.83 g消息灵通的
• 水至100ml

用氢氧化钾(KOH)调节pH值至7.5。储存在4°C。

5X MOPS缓冲区

• 0.2M MOPS (pH 7.0)
• 0.05醋酸钠
• 0.005M EDTA (pH8.0)

取2升缓冲液，将83.72g MOPS(游离酸)和8.23g醋酸钠加入1.6升depc处理过的水中，搅拌至完全溶解。加入20ml depc处理过的0.5M EDTA，用10N NaOH调整pH至7.0。用depc处理过的水将最终体积调至2升。过滤器消毒后分装成等份。

磷酸盐缓冲盐水(PBS)

• 8g NaCl, 0.2g KCl
• 1.44 g Na₂HPO₄
• 0.24 g KH₂阿宝₄

将盐溶解在800毫升蒸馏水中。用盐酸调节pH值为7.4。加水至1升。分装成等份。用高压灭菌法消毒。

PBS(毫克^{2 +}-和Ca^{2 +}无)

• 137毫米氯化钠
• 2.7毫米氯化钾
• 4.3毫米Na₂HPO₄
• 1.4毫米KH₂阿宝₄

最终pH值应在25°C时为7.4。

PBST (pH 7.4)

• 137毫米氯化钠
• 2.7毫米氯化钾
• 8.1毫米Na₂HPO₄
• 1.47毫米KH₂阿宝₄
• 0.05-1% Tween®20

50 x TAE

溶解242g Tris碱和37.2g Na₂EDTA•(2 h₂O)加入900毫升去离子水中。加入57.1ml冰醋酸，用水调节最终体积至1升。储存在室温或4°C。

10 x此种

将108g Tris碱和55g硼酸溶解在900ml去离子水中。加入40ml 0.5M EDTA (pH 8.0)，并将最终体积与水调整为1升。储存在室温或4°C。

TBST

• 20mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 150毫米氯化钠
• Tween®20

TE缓冲

• 10mM Tris-HCl (pH 8.0)
• 1毫米EDTA

十个缓冲

• 40mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 1mM EDTA (pH 8.0)
• 150毫米氯化钠