DNA纯化gydF4y2Ba

质粒纯化的主要考虑是从宿主细菌的染色体DNA和细胞RNA中分离质粒DNA。已经开发了许多方法来产生清除的裂解物，不仅可以去除蛋白质和脂质，还可以有效地去除污染的染色体DNA，同时使质粒DNA在溶液中游离。制备富集质粒DNA的纯化裂解物的方法包括sds -碱性变性(22-23)、盐- sds沉淀(24)和快速煮沸(25)。gydF4y2Ba

sds -碱性变性方法用于所有Promega质粒分离系统，是一种流行的纯化质粒DNA的方法，因为它的整体通用性和一致性。该技术利用共价封闭质粒DNA和染色体DNA片段在变性和再变性特性上的差异。在碱性条件下(pH值11)，质粒和染色体DNA都能有效地变性。在SDS存在的情况下，用高盐缓冲液(如醋酸钾)快速中和有两种影响，有助于该方法的总体有效性。gydF4y2Ba

首先，快速中和导致染色体DNA以链内方式形成碱基对，形成不溶性聚集体，沉淀出溶液。环状质粒DNA共价闭合的性质促进了链间再杂交，使质粒留在溶液中。其次，SDS的钾盐是不溶性的，因此蛋白质和洗涤剂沉淀和聚集，这有助于高分子量染色体DNA的包裹。可溶性和不溶性物质的分离是通过一种清除方法(如过滤、磁清除或离心)来完成的。可溶性质粒DNA已准备好进一步纯化。有几种方法可以从清除的裂解物中纯化质粒DNA。这些包括:gydF4y2Ba

• 在高浓度朝向盐的存在下将质粒与二氧化硅结合(2-4)gydF4y2Ba
• 异向盐/乙醇水溶液中质粒DNA的差异沉淀(26-28)gydF4y2Ba
• deae改性纤维素膜上的离子交换色谱(29)gydF4y2Ba
• 聚乙二醇(30-31)沉淀有机萃取苯酚(32)gydF4y2Ba

质粒DNA纯化的一般考虑gydF4y2Ba

细菌生长和培养条件gydF4y2Ba

优质质粒DNA的成功分离始于培养准备。许多因素可以影响细菌细胞的生长。细菌在液体培养基中的生长分为三个阶段:1)短暂的滞后期，细菌适应培养基并开始分裂;2)以指数增长为特征的对数阶段gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba将每20-30分钟分一次;3)一个固定阶段，在这个阶段中，由于培养基中缺乏营养物质，生长减慢并最终停止。gydF4y2Ba

在固定阶段生物量不会出现净增加，但质粒的复制将在达到固定阶段后继续数小时。大多数的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba会达到1.0-4.0 × 10的浓度吗gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba细胞/ml的培养在这个阶段，取决于培养基和通风条件。根据接种量和培养物的大小，在6-8小时内达到固定期gydF4y2Ba

曝气和温度是至关重要的。培养体积应小于或等于容器体积的1/4(例如，在1升烧瓶中放入250毫升培养基);使用1/10的容器体积(例如，100ml培养基在1000ml烧瓶中)产生最佳结果。培养管或烧瓶应放置在一个轨道振动器(约250rpm)，以确保足够的通气(33)。挡板烧瓶可以增加曝气，从而提高质粒DNA的产量。因为大多数的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在37℃下生长最佳，除非感兴趣的菌株需要不同的条件才能达到最佳生长，否则建议在37℃培养。gydF4y2Ba

不同的培养基也会对不同菌株的生长产生深远的影响。Promega质粒DNA纯化系统适用于在1X Luria-Bertani (LB)培养基中培养的细菌。但是，强烈推荐使用含有更多NaCl的LB-Miller培养基，产量会显著提高。丰富的培养基如2X YT, CIRCLEGROW®或Terrific Broth可以通过增加一定体积的培养物的生物量来提高质粒产量。gydF4y2Ba

将生物量保持在所使用的质粒分离系统可接受的范围内，因为超载可能导致质粒DNA的纯度和产量低(参见gydF4y2Ba生物质加工gydF4y2Ba获取更多信息)。培养时间对分离的质粒DNA的产量和质量都有影响。细菌培养物生长到不足的密度将产生相对较少的DNA。过度生长的培养可能导致次优产量和过多的染色体DNA污染，这是由于细菌细胞在达到固定阶段后的自溶。我们不建议使用培养时间超过18-20小时的培养基。gydF4y2Ba

抗生素的选择gydF4y2Ba

大多数质粒都携带一种特定抗生素耐药性的标记基因。通过在培养基中添加所选择的抗生素，只有含有目标质粒的细胞才能繁殖。将抗生素添加到所需浓度将有助于最大限度地提高质粒产量。请注意，添加过多的抗生素会抑制生长，而添加太少可能会导致混合菌群生长——无论是否有感兴趣的质粒。有关培养中使用的最佳抗生素范围以及抗生素作用和耐药性机制的更多信息，见表5(34)。gydF4y2Ba

表5所示。抗生素的作用方式和耐药机制。gydF4y2Ba

抗生素gydF4y2Ba	作用方式gydF4y2Ba	抗性机制gydF4y2Ba	浓缩的工作。gydF4y2Ba	股票的解决方案gydF4y2Ba
氨苄青霉素(Amp)gydF4y2Ba	青霉素的衍生物，通过干扰细菌细胞壁的合成而杀死生长中的细胞。gydF4y2Ba	抗性基因(gydF4y2BablagydF4y2Ba)指定了一种周围质酶，β-内酰胺酶，它可以切割抗生素的β-内酰胺环。gydF4y2Ba	50 - 125µg / mlgydF4y2Ba	50mg/ml水中gydF4y2Ba
氯霉素(Cm)gydF4y2Ba	一种通过与核糖体的50S亚基结合并阻止肽键形成而干扰细菌蛋白质合成的抑菌剂。gydF4y2Ba	抗性基因(gydF4y2Ba猫gydF4y2Ba)指定一种乙酰转移酶，它使抗生素乙酰化，从而使抗生素失活。gydF4y2Ba	20 - 170µg / mlgydF4y2Ba	34mg/ml乙醇gydF4y2Ba
潮霉素(Hygro)gydF4y2Ba	一种干扰80S核糖体易位并导致误译的蛋白质合成抑制剂。gydF4y2Ba	抗性基因(gydF4y2BahphgydF4y2Ba)指定了一种磷酸转移酶，它催化环醇环上的4-羟基(木糖胺)的磷酸化，从而产生7 ' - o -磷酸基-湿霉素B，该酶在体内和体外都缺乏生物活性。gydF4y2Ba	20 - 200µg / mlgydF4y2Ba	水中100mg/mlgydF4y2Ba
卡那霉素(直)gydF4y2Ba	一种与70S核糖体结合并导致信使RNA误读的杀菌剂。gydF4y2Ba	抗性基因(gydF4y2Ba菅直人gydF4y2Ba)指定修饰抗生素并阻止其与核糖体相互作用的酶(氨基糖苷磷酸转移酶)。gydF4y2Ba	30µg / mlgydF4y2Ba	水中50mg/mgydF4y2Ba
新霉素(Neo)gydF4y2Ba	一种通过与原核生物70S核糖体亚基结合而阻断蛋白质合成的杀菌剂。gydF4y2Ba	细菌氨基糖苷磷酸转移酶基因(源自Tn5)的表达。gydF4y2Ba	50µg / mlgydF4y2Ba	水中25mg/mlgydF4y2Ba
四环素(春节)gydF4y2Ba	一种光敏抑菌剂，通过结合核糖体的30S亚基阻止细菌蛋白质合成。gydF4y2Ba	抗性基因(gydF4y2Ba春节gydF4y2Ba)指定了一种改变细菌膜并阻止抗生素进入细胞的蛋白质。gydF4y2Ba	液体培养10µg/ml;12.5µg/mlgydF4y2Ba	12.5mg/ml乙醇gydF4y2Ba

推荐接种程序gydF4y2Ba

1-100ml培养液gydF4y2Ba

从新鲜划线板(小于5天)上取一个分离菌落，接种含有所需抗生素的LB培养基。收获前在37°C下摇育8-16小时通常可获得高拷贝数质粒的最大产量。为了获得高重复性的产量，确定在一个典型实验中达到的细胞密度，并在随后的每个实验中培养到这个密度。通常情况下，过夜孵育后，在600nm (a)波长下，将培养物稀释十倍的吸光度gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba)，路径长度应在0.10-0.35之间。gydF4y2Ba

100-1000ml培养基gydF4y2Ba

使用新条纹板(小于5天)上的菌落，接种5 - 50ml含有所需抗生素的LB培养基。将发酵剂培养8小时至37°C过夜。第二天，将发酵剂稀释100- 500倍(例如，在1升培养基中加入10ml过夜培养物)，使用该培养物接种含有抗生素补充培养基的较大培养瓶。在收获细胞之前，将这种二次培养培养12-16小时。的一个gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba10倍稀释培养液应为0.10-0.35。与小型培养一样，为了获得高度可重复的产量，确定典型实验中使用的细胞密度，并在随后的每个实验中将培养物培养到该密度。gydF4y2Ba

收获gydF4y2Ba

在收集细菌时，请遵循本指南中列出的条件gydF4y2BaWizard®Plus SV Miniprep DNA纯化系统gydF4y2Ba或者是gydF4y2BaPureYieldgydF4y2Ba™质粒培养基制备系统gydF4y2Ba协议。如果超过推荐的离心时间或速度，球团细胞可能更难重悬。离心时间或离心速度不足可能导致细胞的不完全收获和起始材料的损失。请查阅离心机使用说明书，了解转/转的换算gydF4y2BaggydF4y2Baforce。一旦细菌被制成颗粒，这是净化过程中一个很好的停止点。将颗粒储存在-20°C下，质粒DNA的损失很小，并可能促进裂解。gydF4y2Ba

影响质粒DNA质量和产量的因素gydF4y2Ba

菌株选择gydF4y2Ba

无论采用何种纯化方法，宿主菌株的选择都会对DNA的质量和产量产生重大影响。我们推荐使用DH5α™、JM109 (Cat.#)等宿主菌株gydF4y2BaL2005gydF4y2Ba)和XL1-Blue，它们包含基因突变gydF4y2Ba恩达gydF4y2Ba基因。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株被列为gydF4y2Ba恩达gydF4y2Ba1包含这样的突变。gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba恩达gydF4y2Ba这种酶是一种双链DNA酶，可以与质粒DNA共聚合，从而导致潜在的降解。RNA作为一种竞争性抑制剂，改变了内切酶的特异性，从产生7个碱基寡核苷酸的双链溶核酶到平均每个底物切割一次的酶(35-36)。内切酶I的功能尚不完全清楚，菌株承受gydF4y2Ba结束gydF4y2BaA1突变除了获得的质粒稳定性和产量提高外，没有明显的表型。gydF4y2Ba

内切酶I的表达已被鉴定并发现依赖于细菌生长阶段(37)。在本研究中，发现指数期的内切酶I水平比固定期高300倍以上。此外，促进快速生长的培养基组成(例如，高葡萄糖水平和氨基酸的添加)导致高内切酶I水平。gydF4y2Ba

含有野生型核酸内切酶A (gydF4y2Ba恩达gydF4y2Ba)基因可以产生高质量的、未降解的质粒DNA，如果采用特殊的预防措施来减少核酸酶污染和质粒降解的可能性(37)。Promega在纯化过程的不同阶段进行了彻底的研究，以确保从EndA中分离出高质量的DNAgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(野生型)细菌菌株。这些包括:1)在Wizard®中包含降解核酸酶的碱性蛋白酶处理步骤gydF4y2Ba+gydF4y2BaSV Minipreps DNA纯化系统;2)优化培养条件，限制细菌生长过程中的体内表达;3)净化过程中和净化后的热失活;4)优化协议条件以限制核酸酶与树脂的结合;5)后纯化方法以去除核酸内切酶。Schoenfeld对这些方法和结果进行了总结gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。1995年(38)和gydF4y2BaWizard®Plus SV质粒DNA纯化系统技术公报gydF4y2Ba。细菌菌株的遗传标记信息也可以在Ausubel中找到gydF4y2Ba等gydF4y2Ba。1989(33)和SambrookgydF4y2Ba等gydF4y2Ba。1989(39)。gydF4y2Ba

质粒拷贝数gydF4y2Ba

从一个给定的体系中影响质粒产量的最关键因素之一是质粒的拷贝数。拷贝数主要由质粒复制起始处周围的DNA区域决定。这个区域被称为复制子，通过细菌酶复合物控制质粒DNA的复制。质粒来源于pBR322 (Cat.#)gydF4y2BaD1511gydF4y2Ba)包含从ppmb1复制的ColE1起源。这种复制的起源受到严格控制，导致每个细菌细胞大约有25个质粒拷贝(低拷贝数)。来自pUC的质粒含有ColE1复制起源的突变版本，这导致复制控制减少，每个细胞大约有200-700个质粒拷贝(高拷贝数)。gydF4y2Ba

一些质粒含有p15A复制起点，这被认为是低拷贝数起点。p15A复制起始点的存在允许该特定质粒与含有ColE1复制起始点的质粒结合进行复制。相容性组被定义为一组质粒，其成员不能在同一细菌细胞中共存。它们是不相容的，因为在质粒维持的关键阶段，细菌细胞无法将它们彼此区分开来。新起源的引入，以同一相容性组的第二个质粒的形式，模仿原质粒复制的结果。因此，在两个质粒被分离到不同的细胞中以产生正确的复制前拷贝数(40)之前，任何进一步的复制都被阻止。Promega提供的大多数质粒(包括pGEM®Vectors)被认为是高拷贝数质粒。唯一的例外是pALTER®-MAX Vectors。gydF4y2Ba

一些DNA序列，当插入到一个特定的载体时，可以降低质粒的拷贝数。此外，大的DNA插入也可以减少质粒拷贝数。在许多情况下，不知道特定构造的确切拷贝数。然而，许多这些质粒是从少数常用的亲本结构中衍生出来的。gydF4y2Ba

适当的样品大小和吞吐量gydF4y2Ba

根据细菌培养量的不同，有不同的隔离系统来满足您的需要。对于0.6-3ml的小体积细菌培养，使用PureYield这样的系统gydF4y2Ba™gydF4y2Ba质粒迷你准备系统(Cat.#gydF4y2BaA1223gydF4y2Ba，gydF4y2BaA1222gydF4y2Ba)，其质粒DNA产率为1.5-7.5μggydF4y2Ba_{260 /gydF4y2Ba}一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba0.6ml过夜细菌培养≥1.8，总生物量(odgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba培养量×培养体积(μl)为1.3 ~ 8。gydF4y2Ba

对于容量为50-100ml的大型培养物，使用PureYield™质粒培养基系统(Cat.#)gydF4y2BaA2492gydF4y2Ba，gydF4y2BaA2495gydF4y2Ba，gydF4y2BaA2496gydF4y2Ba)是一个不错的选择。使用该系统，培养50ml高拷贝数质粒，总生物量为100 - 200odgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba单位将产生100-200µg质粒。PureYield™质粒最大准备系统(Cat.#gydF4y2BaA2392gydF4y2Ba，gydF4y2BaA2393gydF4y2Ba)可以从100-250ml培养基中分离出质粒，产量可达1mg带A的质粒DNAgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba从250ml过夜细菌培养物中提取bbb1.7，用高拷贝数质粒转化。gydF4y2Ba

对于高通量处理，基于96井格式的系统可以手动执行真空歧管(例如，Vac-Man®96真空歧管;图16)使用硅膜技术，如Wizard®SV 96质粒DNA纯化系统(Cat.#)gydF4y2BaA2250gydF4y2Ba，gydF4y2BaA2255gydF4y2Ba，gydF4y2BaA2258gydF4y2Ba）.另外，自动化液体处理工作站可以使用MagneSil®pmp和96孔磁铁处理多孔板(例如，MagnaBot®96磁选设备;图17)使用Wizard®MagneSil®质粒纯化系统(Cat.#)gydF4y2BaA1630gydF4y2Ba，gydF4y2BaA1631gydF4y2Ba，gydF4y2BaA1635gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

这些系统使用高拷贝数质粒的产率范围从3-5µg Wizard®SV 96质粒DNA纯化系统和高达6µg Wizard®MagneSil®质粒纯化系统。较小的质粒量有助于通过PCR或限制性酶切评估克隆实验的成功与否，或用于偶联转录/翻译系统，如TNT®快速偶联转录/翻译系统(Cat.#)gydF4y2BaL1170gydF4y2Ba，gydF4y2BaL2080gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

生物质加工gydF4y2Ba

光密度(od)是衡量细菌培养物的生物量在1cm的路径长度中阻挡了多少光的度量。培养密度在600nm波长处测量，对质粒分离成功有很大影响。例如，Wizard®SV 96质粒纯化系统的最大生物量推荐值为4.0 odgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba以避免Wizard®SV 96裂解液清除板(Cat.#)堵塞gydF4y2BaA2241gydF4y2Ba，gydF4y2BaA2248gydF4y2Ba)，因此计算培养物的od是必要的。gydF4y2Ba

od /ml培养= 600nm吸光度读数×稀释系数gydF4y2Ba

对于od的测量，通常使用1:10的稀释(例如，0.1ml培养基在0.9ml培养基中)，以保持读数在0.1-1.0的范围内，此时分光光度计是最准确的。对于上面的例子，如果1:10的稀释读数为0.15，即每毫升培养物为1.5 od，则可处理的培养物不超过2.67ml (4 od除以1.5 od /ml = 2.67ml)。超过质粒净化系统的推荐值可能会导致系统堵塞或污染。gydF4y2Ba

质粒纯化方法及转染gydF4y2Ba

许多质粒分离系统表明它们具有转染质量(例如，PureYield™质粒系统或Wizard MagneSil Tfx™系统，Cat.#)gydF4y2BaA2380gydF4y2Ba）.这可能很重要，因为一些培养细胞对质粒制备中存在的内毒素和其他污染物的量很敏感。内毒素是革兰氏阴性菌(即所有革兰氏阴性菌)外膜的脂多糖细胞壁成分gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba无论使用何种纯化系统，都能与质粒DNA共纯化。该分子的数量因菌株、生长条件和分离方法而异。在PureYield™质粒系统中，有一种内毒素去除洗涤溶液，可以减少用质粒DNA洗脱的内毒素，蛋白质和其他污染物的量。对于许多常见的细胞系，如293和HeLa，常规转染时存在的内毒素量对转染效率的影响很小(41)。gydF4y2Ba

影响转染效率和/或细胞死亡的因素很多，包括转染试剂的种类和数量、细胞的融合度、DNA的数量和与试剂DNA复合物的孵育时间。为了最大限度地减少细胞死亡和提高转染效率，每种转染细胞系-质粒组合都需要对这些因素进行优化。根据我们的经验，HeLa和NIH/3T3细胞转染实验表明，当使用相同的转染试剂比较效率时，使用四种不同的质粒分离系统(基于二氧化硅膜，阴离子交换和二氧化硅树脂)制备的DNA几乎没有差异。然而，用于DNA摄取的转染试剂对转染效率和细胞死亡有显著影响。有关优化的一般注意事项，请参阅我们的gydF4y2Ba转染gydF4y2Ba指南。gydF4y2Ba

二氧化硅柱基系统gydF4y2Ba

Promega产leyu乐鱼网品，如Wizard®gydF4y2Ba+gydF4y2BaSV Minipreps DNA纯化系统(Cat.#gydF4y2BaA1330gydF4y2Ba，gydF4y2BaA1460gydF4y2Ba，gydF4y2BaA1465gydF4y2Ba)和PureYield™质粒系统结合了碱性裂解的优点和快速简便的二氧化硅纯化。这是通过使用柱形式的硅基膜结合清除的碱性裂解物中含有的质粒DNA来完成的。纯化是基于DNA选择性吸附到二氧化硅膜上，在高浓度的朝向盐的存在下，清洗以有效去除污染物，并用低盐溶液(如TE缓冲液或水)洗脱DNA。gydF4y2Ba

纯化的质粒DNA用于许多应用，从制备克隆载体到生成转录或偶联转录/翻译反应的模板。Promega的硅基纯化系统最大限度地减少了分离过程中携带的盐和其他杂质的量，这可能会对下游应用产生负面影响，降低产量或阻止酶系统合成感兴趣的产物。gydF4y2Ba

PureYield™质粒系统gydF4y2Ba

PureYield™质粒系统分离高质量的质粒DNA用于真核转染和体外表达实验。与硅树脂或其他膜柱方法相比，PureYield™系统独特的试剂、专有的基质和基于硅膜的设计大大减少了用于纯化的时间。而独特的内毒素去除洗涤去除蛋白质，RNA和内毒素污染物从结合的DNA，柱清洗溶液后，膜干燥消除盐和醇从质粒准备，允许纯化质粒用于高敏感的应用，如转染，体外转录和耦合体外转录/翻译。另一个好处是，即使使用低拷贝数的质粒也能获得相同程度的纯化。虽然该系统对小于10kb的质粒效果最好，但已经纯化了18kb的质粒。gydF4y2Ba

PureYield™质粒迷你准备系统中独特的试剂组合可以直接从0.6ml细菌培养物中纯化质粒，也可以从3ml细胞培养物中纯化细胞颗粒(图18)。典型的过夜培养在LB培养基中培养16-18小时。如果选择细胞颗粒法，离心收获细胞，然后在600μl TE缓冲液或水中重悬。直接从细菌培养物中纯化DNA只需不到10分钟，洗脱量低至30μl，质粒DNA浓度更高。低洗脱量是可能的，因为柱的设计几乎没有保留缓冲液。使用PureYield™质粒Miniprep系统分离的质粒在不同细胞系中的转染比较如图19所示。gydF4y2Ba

要分离大量高质量的质粒DNA，请使用PureYield™质粒培养基系统。该质粒培养基系统设计用于用A纯化100-200µg质粒DNAgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba如果培养物与高拷贝数质粒一起生长，则在30分钟内从50ml的细菌过夜培养物中获得bbb1.7，达到总光密度(odgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba培养量×培养量)100-200。可处理的体积更大，可达250ml，但需要比PureYield™质粒中层准备系统提供的溶液体积更大。gydF4y2Ba

PureYield™质粒中间体系统设计用于真空净化，使用歧管，如Vac-Man®实验室真空歧管(Cat.#)gydF4y2BaA7231gydF4y2Ba)，但也有替代方案使用所有离心机或真空和离心机。所有方案产生高质量的纯化质粒DNA。摆桶台式离心机或Eluator™真空洗脱装置(Cat.#)gydF4y2BaA1071gydF4y2Ba)，无论选择何种方案，最后的洗脱步骤都需要。gydF4y2Ba

为了获得更大的质粒分离能力，PureYield™质粒最大化系统能够用a纯化高达1mg的质粒DNAgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba从250ml过夜细菌培养物中提取bbb1.7，用高拷贝数质粒在大约60分钟内转化。与介质预处理系统一样，该方案需要真空泵和歧管(例如，Vac-Man®实验室真空歧管，20个样品)，具有固定角度转子的离心机用于裂解物清除，以及具有摆动桶转子的台式离心机或Eluator™真空洗脱装置用于最后洗脱步骤。gydF4y2Ba

向导®SV基于列的系统gydF4y2Ba

高质量的纯化质粒用于自动荧光DNA测序以及其他标准分子生物学技术，包括限制性内切酶消化和PCR。无论您是分离少量样品还是96孔板，都有基于硅膜的系统可用。gydF4y2Ba

手动净化使用Wizard®gydF4y2Ba+gydF4y2BaSV Minipreps DNA纯化系统提供了一种简单可靠的方法，使用柱状二氧化硅膜快速分离质粒DNA(方法概述见图20)。整个迷你准备程序可在30分钟或更短的时间内完成，具体取决于处理的样品数量。从1-10ml过夜的质粒DNA中提取gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba培养物可以使用真空歧管，如Vac-Man®实验室真空歧管(处理多达20个样品)或微型离心机(处理的样品数量取决于转子尺寸)进行纯化。gydF4y2Ba

该系统可用于分离宿主质粒gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba但当质粒小于20,000bp时，效果最好。质粒的产量取决于许多因素，包括细菌培养量、质粒拷贝数、培养基类型和细菌菌株gydF4y2Ba影响质粒DNA质量和产量的因素gydF4y2Ba。SV膜的DNA结合能力可达20µg的优质质粒DNA。分离过程中的碱性蛋白酶处理步骤通过消化酶内切酶I等蛋白质来提高质粒质量。gydF4y2Ba

DNA产量可以用三种不同的物理方法进行评估:吸光度(光密度)、琼脂糖凝胶电泳和荧光DNA结合染料。下面描述了每种技术，并包括必要的附件(如设备)的信息。虽然所有方法都是有用的，但在选择量化方法时，每种方法都有需要考虑的注意事项。gydF4y2Ba

测定DNA产量和纯度最常用的技术也是最简单的方法——吸光度法。测量所需要的只是一个配有紫外灯的分光光度计，紫外透明比色管(取决于仪器)和纯化的DNA溶液。吸光度读数在260nm (A)下进行gydF4y2Ba_260gydF4y2Ba)，其中DNA吸收光线最强烈，产生的数量可以用来估计溶液的浓度。为了确保这些数字是有用的，AgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba读数应在0.1-1.0之间。gydF4y2Ba

然而，DNA并不是唯一能吸收260纳米紫外线的分子。由于RNA在260nm处也有很大的吸光度，而蛋白质中存在的芳香氨基酸在280nm处也有很大的吸光度，所以如果DNA溶液中存在这两种污染物，将有助于260nm处的总测量。此外，胍的存在将导致更高的260nm吸光度。这意味着如果AgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba如果使用number来计算产量，DNA数量可能会被高估(43)。gydF4y2Ba

为了通过分光光度法评估DNA纯度，测量从230nm到320nm的吸光度，以检测DNA溶液中存在的其他可能的污染物。最常见的纯度计算是测定260nm处的吸光度除以280nm处的读数之比。高质量的DNA是AgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba比例为1.7-2.0。读数为1.6并不表示DNA不适合任何应用，但较低的比率表明存在更多的污染物。然而，DNA质量的最佳测试是在相关应用中的功能(例如，实时PCR)。gydF4y2Ba

在230nm附近的强吸光度表明纯化的DNA中存在有机化合物或朝变性盐。260nm与230nm的比值可以帮助评估纯化DNA中的盐携带水平。例如，比例越低，硫氰酸盐的含量就越多。作为指导方针，agydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_230gydF4y2Ba大于1.5是最好的。320nm的读数将表明溶液中是否有浑浊，这是可能受到污染的另一个指示。因此，从230nm到320nm的光谱读数是最有信息的。gydF4y2Ba

纯化DNA的琼脂糖凝胶电泳消除了与吸光度读数相关的一些问题。要使用这种方法，需要一个带外部电源的水平凝胶电泳罐，分析级琼脂糖，适当的运行缓冲液(例如，1X TAE)和插入DNA染料以及适当大小的DNA标准品进行定量。分离的DNA样本被装入琼脂糖凝胶的孔中，然后暴露在电场中。带负电荷的DNA主链向阳极迁移。由于小的DNA片段迁移速度更快，DNA是按大小分开的。凝胶中琼脂糖的百分比将决定DNA的大小范围将以最大的清晰度被分解(40)。与DNA相比，样品中的任何RNA、核苷酸和蛋白质都以不同的速率迁移，因此含有DNA的条带将是不同的。gydF4y2Ba

凝胶电泳完成后，通过将样品的DNA强度与DNA定量标准品的DNA强度进行比较，可以确定样品的浓度和产率。例如，如果凝胶上装载的2µl未稀释DNA样品具有与100ng标准样品相同的近似强度，则溶液浓度为50ng/µl (100ng除以2µl)。用于定量的标准品应被标记，并与被分析的样本DNA大小相同。为了可视化琼脂糖凝胶中的DNA，需要用插入染料如溴化乙啶或SYBR®Green染色。由于溴化乙锭是一种已知的诱变剂，因此需要采取预防措施以正确使用和处置(43)。gydF4y2Ba

DNA结合染料将未知样品与DNA的标准曲线进行比较，但基因组、片段和质粒DNA都需要各自的标准曲线，不能互换使用。如果DNA样本被稀释，在计算最终浓度时需要考虑稀释系数。Hoechst双苯并咪唑染料或PicoGreen选择性结合双链DNA (dsDNA)。要使用这种方法，需要荧光计检测染料，稀释DNA溶液和适当的DNA标准。然而，有大小限制:Hoechst的DNA长度至少为1千碱基，PicoGreen®的DNA长度至少为200bp，才能成功定量。Hoechst的测量范围为10-250ng /ml, PicoGreen®的测量范围为25pg/ml - 1µg/ml，染料对GC含量敏感。此外，处理荧光化合物的通常注意事项-光漂白和猝灭将影响信号。虽然染料优先与双链dna结合，但RNA和核苷酸可能有助于信号。gydF4y2Ba

选择使用哪种定量方法是基于许多因素，包括设备或试剂的使用，浓度计算的可靠性和一致性。在比较不同方法的产率时要谨慎，因为潜在污染物的水平可能导致不同方法之间的测定结果不同。gydF4y2Ba