PCR扩增

本讨论的重点是Taq DNA聚合酶在PCR中的应用，因为这是PCR中最常用的酶。这些建议在使用其他DNA聚合酶时也同样适用。

镁浓度

镁是耐热性DNA聚合酶必需的辅助因子，镁的浓度是影响扩增成功的关键因素。模板DNA浓度、样品中存在的螯合剂(如EDTA或柠檬酸盐)、dNTP浓度和蛋白质的存在都可以影响反应中游离镁的量。在缺乏足够的游离镁的情况下，Taq DNA聚合酶是不活跃的。过量的游离镁降低酶保真度(Eckert和Kunkel, 1990)，并可能增加非特异性扩增水平(Williams, 1989;埃尔斯沃斯等．1993)。由于这些原因，研究人员应该根据经验确定每个目标的最佳镁浓度。为此，建立一系列含有1.0-4.0mM Mg的反应^{2 +}以0.5-1mM为增量，并可视化结果，以确定哪种镁浓度产生的产品产量最高，非特异性产品的数量最少。不同的DNA聚合酶不同，镁浓度的影响和最佳浓度范围也不同。例如，Pfu DNA聚合酶的性能似乎对镁浓度的依赖性较小，但当需要进行优化时，最佳浓度通常在2-6mM范围内。

许多DNA聚合酶提供无镁反应缓冲液和一管25mM MgCl₂这样你就可以调整Mg^{2 +}每个反应的浓度达到最佳水平。在组装反应之前，一定要在使用前完全融化镁溶液，并在移液前将镁溶液旋转几秒钟。氯化镁溶液经过多次冻融循环后会形成浓度梯度，需要涡旋混合才能得到均匀的溶液。这两个步骤，虽然看似简单，却消除了许多实验失败的原因。

一些科学家更喜欢使用已经含有MgCl的反应缓冲液₂最终浓度为1.5mM。然而，应该指出的是，胡等．(1992)报道了含镁的反应缓冲溶液的性能变异性。在他们的实验中观察到的0.6mM的游离镁变化显著地影响了等位基因特异性的扩增产量。作者发现，在90°C下加热缓冲液10分钟可以恢复溶液的均匀性。他们假设氯化镁沉淀是多次冻融循环的结果。

缓冲区的考虑

大多数反应缓冲液由缓冲剂(通常是tris基缓冲剂)和盐(通常是KCl)组成。缓冲液调节反应的pH值，从而影响DNA聚合酶的活性和保真度。适度浓度的KCl会使DNA聚合酶活性比无KCl时提高50-60%;50mM KCl被认为是最佳的(Gelfand, 1989)。

GoTaq®DNA聚合酶含有原生Taq DNA聚合酶的专有配方。它配有5X绿色GoTaq®反应缓冲液和5X无色GoTaq®反应缓冲液。5X Green GoTaq®反应缓冲液含有蓝色和黄色染料，在电泳过程中分离，以监测迁移过程。该缓冲液还包含一种化合物，该化合物可增加样品的密度，使其沉入琼脂糖凝胶的孔中，使反应直接加载到琼脂糖凝胶上，而不需要加载染料。在1%琼脂糖凝胶中，蓝色染料的聚合速率与3-5kb DNA片段相同。在1%琼脂糖凝胶中，黄色染料的迁移速度比引物快(<50bp)。5X无色GoTaq®反应缓冲液和5X绿色GoTaq®反应缓冲液具有相同的配方，除了染料。5X无色GoTaq®反应缓冲液被推荐用于在没有事先清理的情况下对PCR扩增器进行吸光度或荧光测量的任何应用。两种缓冲液的pH值均为8.5，并含有MgCl₂浓度为7.5mM，最终浓度为1.5mM。

GoTaq®弹性DNA聚合酶提供5X绿色GoTaq®弹性反应缓冲液和5X无色GoTaq®弹性反应缓冲液。该成分与5X绿色GoTaq®反应缓冲液和5X无色GoTaq®反应缓冲液相同，除了GoTaq®弹性反应缓冲液不含MgCl₂．相反，GoTaq®柔性DNA聚合酶提供了一管25mM MgCl₂所以反应可以用不同浓度的镁来补充。

酶浓度

我们建议在50μl的扩增反应中使用1-1.25单位的Taq DNA聚合酶。在大多数情况下，这是酶的过量，添加更多的酶不会显著提高产品收率。事实上，酶量的增加增加了产生与Taq DNA聚合酶的固有5 '→3 '外切酶活性相关的伪影的可能性，导致琼脂糖凝胶中的涂布带(Longley等．1990;贝尔和德马尼，1991)。

移液错误是酶水平过高的常见原因。在50%甘油中精确分配小体积的酶溶液是困难的，因此我们强烈建议准备一个反应主混合物，这需要更大体积的每种试剂，以减少移液误差。

PCR引物设计

PCR引物定义了要扩增的目标区域，长度一般为15-30个碱基。理想情况下引物的gc含量为40-60%。避免在引物的3 '端附近连续出现三个G或C残留，以最大限度地减少引物的非特异性退火。此外，避免使用具有分子内或分子间互补序列的引物，以尽量减少引物-二聚体的产生。二级结构的分子内区域会干扰引物到模板的退火，应该避免。

理想情况下，两种引物的熔化温度(Tm)，即50%引物分子退火到互补序列的温度应在5℃以内，以便引物在相同温度下有效退火。引物可以设计为包括对下游应用有用的序列。例如，可以将限制性内切酶位点放置在PCR引物的5 '端以方便后续PCR产物的克隆，或者可以添加T7 RNA聚合酶启动子以允许体外转录，而无需将PCR产物亚克隆到载体中。

模板质量

成功的扩增取决于DNA模板的数量和质量。常用于纯化核酸的试剂(盐类、胍类、蛋白酶、有机溶剂和SDS)是DNleyu体育靠谱吗A聚合酶的有效灭活剂。例如，0.01% SDS将抑制Taq DNA聚合酶90%，而0.1% SDS将抑制Taq DNA聚合酶99.9% (Konat等．1994)。其他一些PCR抑制剂的例子是苯酚(Katcher and Schwartz, 1994)，肝素(Beutler等．1990;Holodniy等．1991)，二甲苯氰醇，溴酚蓝(Hoppe等．1992)，植物多糖(Demeke和Adams, 1992)，以及多胺精胺和亚精胺(Ahokas和Erkkila, 1993)。在某些情况下，该抑制剂不被引入与核酸模板的反应中。leyu体育靠谱吗这方面的一个很好的例子是一种抑制物质，可以从聚苯乙烯或聚丙烯在紫外线照射下释放(Pao等．1993;Linquist等．1998)。

如果扩增反应失败，并且您怀疑DNA模板被抑制剂污染，则将可疑DNA制剂添加到具有过去扩增良好的DNA模板和引物对的对照反应中。对照DNA扩增失败通常表明存在抑制剂。清除DNA制剂的其他步骤，如苯酚:氯仿萃取或乙醇沉淀，可能是必要的。

模板数量

成功扩增所需模板的数量取决于DNA样本的复杂性。例如，一个包含1kb目标序列的4kb质粒，输入DNA的25%是感兴趣的目标。相反，人类基因组中一个1kb的目标序列(3.3 × 10⁹bp)约为输入DNA的0.00003%。因此，每次反应需要大约100万倍以上的人类基因组DNA来维持相同数量的目标拷贝。常见的错误包括使用太多的质粒DNA，太多的PCR产物或太少的基因组DNA作为模板。DNA模板太少的反应会产生低产量，而DNA模板太多的反应会受到非特异性扩增的困扰。如果可能的话，从>开始⁴在25-30个周期内复制目标序列以获得信号，但尽量保持反应的最终DNA浓度≤10ng/μl。当重新扩增PCR产物时，通常不知道特定PCR产物的浓度。我们建议将之前的扩增反应稀释1:10至1:10 000再扩增。

1μg 1kb RNA = 1.77 × 10¹²分子

1μg 1kb dsDNA = 9.12 × 10¹¹分子

1μg pGEM®Vector DNA = 2.85 × 10¹¹分子

1μg lambda DNA = 1.9 × 10¹⁰分子

1μg大肠杆菌基因组DNA = 2 × 10⁸分子

1μg人类基因组DNA = 3.04 × 10⁵分子

循环参数

最常改变的两个循环参数是退火温度和拉伸时间。PCR周期其他步骤的长度和温度通常变化不大。然而，在某些情况下，可以缩短变性周期或使用较低的变性温度来减少脱嘌呤事件的数量，这可能导致PCR产物的突变。leyu乐鱼网

引物顺序是决定最佳退火温度的主要因素，其温度往往在引物熔化温度5℃以内。采用略高于引物Tm的退火温度可以增加退火的严格性，并可以最大限度地减少引物的非特异性退火，减少不需要的产物的合成量。leyu乐鱼网使用比引物Tm低的退火温度可以获得更高的产量，因为引物在较低的温度下退火更有效。我们建议测试几种退火温度，从低于Tm约5°C开始，以确定最佳退火条件。在许多情况下，可以通过优化退火温度来减少非特异性扩增和引物-二聚体的形成，但如果不理想的PCR产物仍然是一个问题，可以考虑结合许多热启动PCR方法中的一种。leyu乐鱼网

寡核苷酸合成设备通常可以估计引物的Tm。Tm也可以用Biomath计算器．有许多公式可以确定核酸的理论Tm(巴尔迪诺，Jr。leyu体育靠谱吗等．1989;Rychlik等．1990)。寡核苷酸的熔化温度可由下式估算:

Tm = 81.5 + 16.6××(log10 (Na +)) + 0.41 (% G + C) - 675 / n

其中[Na+]是摩尔盐浓度，n =寡核苷酸中的碱基数

的例子。计算含60% G+C的22聚寡核苷酸在50mM KCl中的熔化温度:

Tm = 81.5 + 16.6××(log10 [0.05]) + 0.41 (60) - 675/22

= 81.5 + 16.6 ×(- 1.30) + 24.60 - 30.68 = 54°c

延伸周期的长度可能需要优化，这取决于PCR产物的大小和所使用的DNA聚合酶。一般来说，每1kb的扩增子允许1分钟(最小扩增时间= 1分钟)用于非校对DNA聚合酶，每1kb的扩增子允许2分钟用于校对DNA聚合酶。避免过长的延长时间，因为它们会增加产生与Taq DNA聚合酶固有的5 '→3 '外切酶活性相关的伪象的可能性(Longley等．1990;贝尔和德马尼，1991)。

PCR通常涉及25-35个扩增循环。反应中出现不良PCR产物的风险随着循环次数的增加而增加，leyu乐鱼网因此我们建议只进行足够的循环来合成所需数量的产物。如果在合成足够数量的PCR产物之前，非特异性扩增产物已经积leyu乐鱼网累，可以考虑稀释第一次反应的产物，并使用相同的引物进行第二次扩增，或使用所需PCR产物中退火序列的引物(嵌套引物)。

PCR增强剂和添加剂

添加PCR增强剂可以增加期望PCR产物的产量或减少期望产物的产量。leyu乐鱼网有许多PCR增强子，它们可以通过许多不同的机制起作用。这些试剂不会增强所有pcr;有益的效果通常是模板和引物特异性的，需要根据经验来确定。下面讨论一些比较常见的增强剂。

添加甜菜碱、DMSO和甲酰胺有助于扩增富gc模板和形成强二级结构的模板，这可能导致DNA聚合酶失速。富gc模板可能存在问题，因为两条DNA链的分离效率不高，或者互补的富gc引物形成分子间二级结构的趋势，这将与引物退火到模板的竞争。甜菜碱降低了分离DNA链所需的能量(Rees等．1993)。DMSO和甲酰胺被认为以类似的方式通过干扰两条DNA链之间的氢键形成来促进扩增(Geiduschek和Herskovits, 1961)。

一些在没有增强子的情况下扩增效果较差的反应，当加入甜菜碱(1M)、DMSO(1-10%)或甲酰胺(1-10%)时，PCR产物的产率会更高。DMSO浓度大于10%，甲酰胺浓度大于5%，可以抑制Taq DNA聚合酶，也可能抑制其他DNA聚合酶(Varadaraj和Skinner, 1994)。

在某些情况下，一般的稳定剂如BSA (0.1mg/ml)、明胶(0.1-1.0%)和非离子洗涤剂(0-0.5%)可以克服扩增失败。这些添加剂可以增加DNA聚合酶的稳定性，减少试剂通过吸附到管壁的损失。BSA也被证明可以克服黑色素对RT-PCR的抑制作用(Giambernardi等．1998)。非离子洗涤剂，如Tween®-20、NP-40和Triton®X-100，具有克服微量强离子洗涤剂(如0.01% SDS)抑制作用的额外好处(Gelfand和White, 1990)。铵离子可以使放大反应在非最佳条件下更耐受。因此，一些PCR试剂包括10-20mM (NH4)₂所以₄．其他PCR增强剂包括甘油(5-20%)、聚乙二醇(5-15%)和四甲基氯化铵(60mM)。

leyu体育靠谱吗核酸交叉污染

重要的是尽量减少样品之间的交叉污染，防止RNA和DNA从一个实验转移到下一个实验。在扩增前和扩增后步骤中使用单独的工作区域和移液器。使用正位移移液管或防气溶胶的尖端，以减少移液过程中的交叉污染。戴手套，经常更换。

有许多技术可以用来防止污染DNA的扩增。PCR试剂可以用异补骨脂素处理，异补骨脂素是一种光激活的交联试剂，插入双链DNA分子并形成共价链间交联，以防止DNA变性和复制。这些链间交联有效地使污染的DNA无法放大。

用尿嘧啶- n -糖基化酶(UNG)处理PCR试剂，这是一种DNA修复酶，可水解尿嘧啶残基上的碱基核糖键，消除了DNA污染最常见的来源之一:先前扩增的PCR产物。leyu乐鱼网UNG处理通过导致DNA聚合酶在产生的碱基位点上停滞，从而阻止含尿嘧啶DNA的复制。为了使UNG有效地防止污染，以前放大的产物必须在dUTP存在的情况下合成。leyu乐鱼网这很容易通过用dUTP代替反应中的部分或全部dTTP来实现。非校对聚合酶很容易将dUTP合并到PCR产物中，但校对聚合酶合并dUTP的效率要低得多(Slupphaug等．1993;Greagget al。1999;Lasken等．1996)。dUTP掺入对溴化乙锭的染色强度和PCR产物的电泳迁移率没有明显影响，因此可以用标准琼脂糖凝胶电泳分析反应。虽然这两种方法都是有效的(Rys和Persing, 1993)，但UNG处理的优点是单链和双链DNA模板都将被渲染成不可扩增的(Longoet al。1990)。

请参阅PCR优化的一般考虑因素(上面)。文中讨论的许多重要参数也适用于RT-PCR。关于RT-PCR常用的逆转录酶的讨论，请参见耐热聚合酶和逆转录酶部分(如下)。

模板注意事项

对于RT-PCR，成功的逆转录取决于RNA的完整性和纯度。Blumberg在1987年描述了创建和维持无核糖核酸酶(RNase-free)环境以最小化RNA降解的过程。强烈建议使用RNase抑制剂(例如，重组RNasin®核糖核酸酶抑制剂)。为了获得最佳结果，RNA模板，无论是总RNA制备，mRNA群体或合成的RNA转录本，都应该是无DNA的，以避免污染DNA的扩增。PCR最常用的DNA聚合酶在标准反应条件下没有逆转录酶活性，因此只有模板中含有微量相似序列的DNA才会产生扩增产物。leyu乐鱼网

成功的RT-PCR也取决于RNA的数量，这可能需要改变以确定最佳的数量。使用Access和AccessQuick™RT-PCR系统，每次反应的总RNA模板水平在1pg-1μg范围内(图3)或poly(A)+ RNA模板水平在1pg-100ng范围内，可以获得良好的扩增结果。

逆转录引物设计

反转录引物的选择取决于目标mRNA的大小和二级结构的存在。例如，当逆转录长mrna的5 '端或具有显著二级结构的分子时，一个专门对转录本的3 '端进行处理的引物(序列特异性引物或寡聚(dT)引物)可能会出现问题，这可能导致逆转录酶在cDNA合成过程中暂停。随机六聚体在转录本上的多个点启动逆转录。因此，它们对长mrna或具有重要二级结构的转录本都很有用。

只要有可能，我们建议使用只退火特定RNA中已定义序列的引物(序列特异性引物)，而不是退火样本中的整个RNA种群(例如，随机六聚体或寡聚物(dT)引物)。为了区分cDNA扩增和污染基因组DNA扩增，设计引物对内含子两侧的外显子序列进行退火，这样从基因组DNA衍生的任何扩增产物都会比从目标cDNA扩增出的产物大得多。这种大小差异不仅可以通过凝胶电泳区分两种产物，而且有利于合成更小的cdna衍生产物(小片段的扩增通常比长片段的扩增更有效)。leyu乐鱼网

无论引物选择如何，反应中的最终引物浓度通常在0.1-1.0μM范围内，但这可能需要优化。我们建议使用最终浓度为1μM的引物(50μl反应中50pmol)作为优化的起点。PCR引物设计的更多信息请参见PCR引物设计部分。

循环参数

使用AMV逆转录酶在37-45°C或在37-42°M-MLV逆转录酶在20- 60分钟内即可完成高效的第一链cDNA合成。在使用AMV RT时，我们建议使用序列特异性引物，并在45°C下进行45分钟的逆转录作为起点。较高的反应温度将减少RNA二级结构的影响，并促进全长cDNA的合成。使用随机六聚体和寡聚(dT)引物分别在室温(20-25℃)和37℃下进行第一链cDNA合成。

Access和AccessQuick™RT-PCR系统在启动反转录反应之前不需要RNA变性。然而，如果需要，可通过在94°C下孵育包含引物和RNA模板的单独管2分钟来加入变性步骤。不要在94℃下孵育AMV逆转录酶;它将被灭活。然后将模板/引物混合物冷却至45°C，并添加到RT-PCR混合物中，在45°C下进行标准逆转录孵卵。在逆转录之后，我们建议在94°C下孵育2分钟，以变性RNA/cDNA杂交，灭活AMV逆转录酶，并从cDNA中分离AMV RT。据报道，AMV逆转录酶必须失活才能获得高产量的扩增产物(Sellner等．1992;Chumakov, 1994)。

大多数RNA样本可通过30-40次扩增检测。如果目标RNA稀少，或者只有少量的起始材料可用，则可能需要将循环次数增加到45或50次，或者稀释第一次反应的产物并重新扩增。leyu乐鱼网

耐热DNA聚合酶

在PCR中使用耐高温DNA聚合酶之前，研究人员必须在每个变性周期后费力地用新鲜的酶(如Klenow或T4 DNA聚合酶)补充反应。耐热性DNA聚合酶因其耐高温变性的能力而革新和推广了PCR。耐热性DNA聚合酶的使用也允许更高的退火温度，这提高了引物退火的严格性。

耐高温DNA聚合酶可用于单酶或双酶RT-PCR (Myers和Gelfand, 1991;Chiocchia和Smith, 1997)。例如，在Mn存在的情况下，Tth DNA聚合酶可以作为逆转录酶^{2 +}用于单酶RT-PCR (Myers和Gelfand, 1991)。在双酶RT- pcr中，下面提到的所有DNA聚合酶都可以用来扩增由逆转录酶(如AMV RT)产生的第一链cDNA。

耐高温DNA聚合酶可分为两组:具有3 '→5 '外切酶(校对)活性的DNA聚合酶，如Pfu DNA聚合酶，以及没有校对功能的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶。这两个群体有一些重要的区别。校对DNA聚合酶比非校对聚合酶更准确，因为3 '→5 '外切酶活性，可以从生长的DNA链中去除误结合的核苷酸。当扩增产物克隆、表达或用于突变分析时，Pfu DNA聚合酶具有较高的保真度，是较好的选择。然而，对于常规PCR，其目标是简单地检测扩增产物，Taq DNA聚合酶是最常用的酶，因为使用非校对DNA聚合酶的产量往往更高。

使用未经校对的DNA聚合酶进行扩增会导致在PCR产物的3 '端添加一个与模板无关的单核苷酸，而使用校对的DNA聚合酶则会导致钝端PCR产物(Clark, 1988;leyu乐鱼网胡,1993)。单核苷酸过剩可以简化PCR产物的克隆。leyu乐鱼网

校对DNA聚合酶也与非校对DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶的氨基末端截断版本混合使用，以比单独使用非校对DNA聚合酶更准确地放大更长的DNA片段(Barnes, 1994;克莱因等．1996)。

Taq DNA聚合酶

分离得到Taq DNA聚合酶水生栖热菌在Mg存在的情况下，催化核苷酸在5 '→3 '方向上的引物依赖性合并到双链DNA中^{2 +}．该酶不具有3 '→5 '外切酶活性，但具有5 '→3 '外切酶活性。

Taq DNA聚合酶适用于大多数不需要高保真酶的PCR应用，例如检测特定的DNA或RNA序列。Taq DNA聚合酶的误差率约为1 × 10⁵误差/基数，尽管保真度在一定程度上取决于反应条件。在较低的pH值、较低的镁浓度和相对较低的dNTP浓度下，保真度略高(Eckert和Kunkel, 1990;Eckert和Kunkel, 1991)。

Taq DNA聚合酶常用来扩增5kb或更小的PCR产物。leyu乐鱼网Taq leyu乐鱼网DNA聚合酶可以扩增出5-10kb范围内的PCR产物，但通常比较小的PCR产物需要更多的优化。对于大于leyu乐鱼网大约10kb的产物，我们推荐为长PCR设计的酶或酶混合物和反应条件。

Taq DNA聚合酶是一种加工酶，在70°C时扩展速率为>60核苷酸/秒(Innis等．1988)，因此每1kb扩增1分钟的扩增步长就足以产生全长PCR产物。leyu乐鱼网酶的半衰期为40分钟，在95°C(律师等．1993)。因为Taq DNA聚合酶是一种非校对聚合酶，用Taq DNA聚合酶生成的PCR产物将包含一个单核苷酸3 '悬垂，通常是3 ' aleyu乐鱼网悬垂。

Tfl DNA聚合酶

Tfl DNA聚合酶在Mg存在下催化核苷酸的引物依赖性聚合成双链DNA^{2 +}．当Mn存在时^{2 +}， Tfl DNA聚合酶可以使用RNA作为模板。Tfl DNA聚合酶具有5 '→3 '外切酶活性，而缺乏3 '→5 '外切酶活性。这种酶通常用于PCR (Gaensslen . PCR)等．1992)，其活性与Taq DNA聚合酶相似。Tfl DNA聚合酶用于Access和AccessQuick™RT-PCR系统。

DNA聚合酶

在MgCl存在的情况下，Tth DNA聚合酶催化核苷酸在5 '→3 '方向聚合成双链DNA₂．在MnCl存在的情况下，酶可以使用RNA模板₂(Myers and Gelfand, 1991;Ruttimann等．1985)。DNA聚合酶表现出5 '→3 '外切酶活性，但缺乏可检测的3 '→5 '外切酶活性。Tth DNA聚合酶的误差率为7.7 × 10⁵错误/基地(荒川等．1996)。Tth DNA聚合酶可以在酚饱和缓冲液的存在下扩增目标DNA (Katcher和Schwartz, 1994)，据报道，与其他耐热聚合酶相比，Tth DNA聚合酶更能抵抗血液成分的抑制(Ehrlich等．1991;Bej和Mahbubani, 1992)。

Tth DNA聚合酶通常用于PCR (Myers和Gelfand, 1991;Carballeira等．1990)和RT-PCR (Myers and Gelfand, 1991;Chiocchia和Smith, 1997)。对于引物延伸、RT-PCR和利用复杂二级结构的RNA模板合成cDNA, Tth DNA聚合酶的高反应温度可能比更常用的逆转录酶(如AMV和M-MLV逆转录酶)具有优势。重组Tth DNA聚合酶已被证明具有RNase H-like活性(Auer等．1995)。

Pfu DNA聚合酶

Pfu DNA聚合酶是所有已知的用于扩增的嗜热DNA聚合酶中错误率最低的酶之一，因为它具有高的3 '→5 '外切酶活性(Cline等．1996;安德烈等．1997)。在PCR后克隆和表达DNA时，Pfu DNA聚合酶通常是首选的酶。Pfu DNA聚合酶可单独用于将DNA片段扩增至5kb，延长时间为每千碱基2分钟。它也用于与缺乏校对功能的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的混合，以获得比单独使用Pfu DNA聚合酶更长的扩增产物(Barnes, 1994)。leyu乐鱼网然而，校对活性可以缩短PCR引物，导致产量降低和非特异性扩增增加。

反转录酶

逆转录酶或依赖rna的DNA聚合酶的发现及其在逆转录病毒感染中的作用(Baltimore, 1970;Temin和Mizutani, 1970)改变了分子生物学的中心法则:DNA→RNA→蛋白质。逆转录酶使用RNA模板来合成DNA，需要一个引物来合成，就像其他DNA聚合酶一样。对于体外应用，引物可以是寡核苷酸(dT)，它与真核mrna的poly(A)+尾部杂交;随机六聚体，它在RNA模板的整个长度中启动合成;或者是序列特异性引物，它与RNA模板中的已知序列杂交。然后从引物进行聚合，就像依赖DNA的DNA聚合酶一样。常用的逆转录酶，AMV逆转录酶，M-MLV逆转录酶和M-MLV逆转录酶，RNase H minus，在不同的最佳温度下(AMV, 42°C;M-MLV 37°C;和M-MLV RT, RNase H -， 42°C)。

一些逆转录酶还具有固有的3 ' -或5 ' -外核糖核酸酶(RNase)活性，通常用于在第一链cDNA合成后降解RNA模板。5 ' -核糖核酸外切酶(RNase H)活性的缺失可能有助于长cdna的产生(Berger等．1983)。

一些依赖DNA的DNA聚合酶也具有逆转录酶活性，在一定条件下，逆转录酶活性是有利的。例如，耐热的，DNA依赖的Tth DNA聚合酶显示逆转录酶活性时，Mn^{2 +}取代Mg^{2 +}作为一种反应。

AMV逆转录酶

AMV RT催化DNA聚合使用模板DNA, RNA或RNA:DNA杂交(Houts等．1979)。AMV逆转录酶具有较高的反应温度(最高可达58℃)，是二级结构高的模板的首选逆转录酶。AMV RT用于广泛的应用，包括cDNA合成(Houts等．1979;Gubler和Hoffman, 1983)， RT-PCR和cDNA末端的快速扩增(RACE;斯金纳等．1994)。尽管较高的最佳温度(42°C)使其成为使用复杂二级结构模板合成cDNA的首选酶，但其相对较高的RNase H活性限制了其生成长cDNA (>5kb)的有用性。对于这些模板，M-MLV RT或M-MLV RT, RNase H minus可能是更好的选择。

M-MLV逆转录酶

M-MLV RT是一种单多肽、rna依赖的DNA聚合酶。该酶在高酶水平下也具有DNA依赖的DNA聚合酶活性(Rothet al。1985)。M-MLV RT用于多种应用，包括cDNA合成、RT- pcr和RACE (Gerard, 1983)。与AMV RT相比，其相对较低的RNase H活性使M-MLV RT成为生成长cdna的首选酶(>5kb) (Sambrook和Russell, 2001)。然而，对于二级结构复杂的短模板，AMV RT或M-MLV RT, RNase H minus可能是更好的选择，因为它们的最佳温度更高。M-MLV RT比AMV RT的加工能力更弱，因此可能需要更多的M-MLV RT才能产生相同数量的cDNA (Schaefer, 1995)。

M-MLV逆转录酶，RNase H -

M-MLV逆转录酶，即RNase H minus，是一种依赖RNA的5 '→3 ' DNA聚合酶，它已被基因改造以去除相关的核糖核酸酶H活性，从而导致RNA:DNA杂化体的RNA链降解(Tanese和Goff, 1988)。RNase H活性的缺失使得M-MLV, RNase H minus，成为生成长cdna的首选酶(>5kb)。然而，对于二级结构复杂的较短模板，AMV逆转录酶可能是更好的选择，因为它可以在较高的反应温度下使用。

M-MLV有RNase H -两种形式:缺失突变体和点突变体。顾名思义，缺失突变体删除了RNase H域的一个特定序列，而点突变体在RNase H域引入了一个点突变。虽然原生M-MLV RT的推荐反应温度为37°C，但缺失突变体和点突变体在更高温度下更稳定，可分别在高达50°C和55°C的反应温度下使用，这取决于所使用的反转录引物。点突变体通常优于缺失突变体，因为点突变体的DNA聚合酶活性与野生型M-MLV酶相当，而缺失突变体的DNA聚合酶活性与野生型M-MLV酶相比略有降低(图4)。

端点PCR协议- GoTaq®G2 DNA聚合酶

所需的材料

• GoTaq®G2 DNA聚合酶和反应缓冲液(Cat。# M7841)
• PCR核苷酸混合(Cat。# C1141)
• 无核酸酶水(Cat。# P1193)
• 上游引物
• 下游引物
• DNA模板
• 矿物油(可选)

1. 在无菌、无核酸酶的微量离心管中，将以下成分在冰上混合:
   
   

组件	体积	最终浓度
5X绿色或无色GoTaq®反应缓冲液1	10µl	1X (1.5mM MgCl2）2
PCR核苷酸混合，10mM	1µl	每个dNTP 0.2mM
上游引物	Xµl	0.1 - -1.0µM
下游引物	Yµl	0.1 - -1.0µM
GoTaq®G2 DNA聚合酶(5u/µl)	0.25µl	1.25 u
DNA模板	Zµl	< 0.5µg / 50µl
Nuclease-Free水	50µl

¹在使用前完全解冻，并彻底涡旋。
²更多MgCl₂可以加入到反应中使用25mM MgCl₂解决方案(猫。# A3511)

2. 如果使用没有加热盖子的热循环器，在反应混合物上涂1-2滴(约50 μ l)矿物油，以防止热循环过程中的蒸发。将反应置于微型离心机中离心5秒。
3. 将反应放入加热至94-95°C的热循环器中，开始PCR。