限制酶资源gydF4y2Ba

限制性内切酶识别短DNA序列，并在这些序列内或邻近的特定位点切割双链DNA。大约有3000种限制性内切酶，可以识别230多个不同的DNA序列。它们主要存在于细菌中，但也从病毒、古生菌和真核生物中分离出来。据估计，25%的细菌至少含有一种限制性内切酶gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}在一个物种中发现了多达7种gydF4y2Ba^{（2）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

在20世纪50年代早期，Luria和他的同事gydF4y2Ba^{（3gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4）gydF4y2Ba}报告了一个被称为主机控制的限制修改的现象。他们观察到，在一种菌株中生长良好的噬菌体往往在一秒钟内生长不良，只形成几个空斑。从这些斑块中分离出的噬菌体能够再次感染第二株菌株并生长良好，但失去了在原始菌株上生长的能力。gydF4y2Ba

阿伯和杜索瓦gydF4y2Ba^{（5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6）gydF4y2Ba}提出了一个解释宿主控制的限制性修饰的分子模型。他们假设，某些菌株含有一种能够切割DNA的内切酶，而一些菌株含有一种菌株特异性的修饰系统，负责保护宿主DNA不受其自身内切酶的作用。未修饰的(外来)DNA，如感染噬菌体的DNA，被内切酶降解，限制噬菌体感染(因此称为限制性内切酶)。然而，一小部分噬菌体DNA在被核酸内切酶降解之前被修饰。这种修改后的DNA能够成功复制并感染第二个宿主，但由于该宿主不包含与第一个宿主相同的修改系统，修改后的噬菌体失去了在原始宿主上复制的能力。gydF4y2Ba

1968年，Arber和Linn证明了Eco B限制性内切酶的核酸酶活性gydF4y2Ba^{(7）gydF4y2Ba}Meselson和Yuan纯化了一种类似的酶gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaKgydF4y2Ba^{（8）gydF4y2Ba}．这些酶后来被归类为I型限制性内切酶，它在随机位置切割DNA，通常远离识别位点。gydF4y2Ba

1970年，史密斯和同事描述了第一个II型限制性内切酶Hind II的纯化gydF4y2Ba^{（9)gydF4y2Ba}，并对其识别和裂解位点进行了表征gydF4y2Ba^{（10）gydF4y2Ba}．维尔纳·阿伯、汉密尔顿·o·史密斯和丹尼尔·内森因发现限制性内切酶及其在分子遗传学中的应用而共同获得1978年诺贝尔医学和生理学奖。由于这些酶能够在特定的识别位点切割DNA，它们在克隆和DNA分型应用中继续发挥着重要作用。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

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回到顶部gydF4y2Ba

A.酶的分类gydF4y2Ba

限制性内切酶可分为四大类之一(gydF4y2Ba类型我gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba归巢内切酶gydF4y2Ba根据它们的亚基结构、辅因子需求、裂解的特异性和相关的甲基化酶活性(gydF4y2Ba表1.2gydF4y2Ba)．参考文献1-10提供了每种限制性内切酶类型的综述如下:II型和II型亚类gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba（2）gydF4y2Ba（3）gydF4y2Ba}IIb型gydF4y2Ba^{（4）gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba}IIe型gydF4y2Ba^{(6）gydF4y2Ba(7）gydF4y2Ba}， IIs类型gydF4y2Ba^{（8）gydF4y2Ba}，归巢内切酶gydF4y2Ba^{（9)gydF4y2Ba}，以及I型和III型gydF4y2Ba^{（10）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

B.限制/修改系统gydF4y2Ba

I型、II型和III型限制性内切酶具有伴甲基化酶，它们识别与内切酶相同的序列，并在特定的碱基和位置甲基化每条链，从而产生4-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或6-甲基腺嘌呤。一旦甲基化，宿主DNA就不再是核酸内切酶的底物。gydF4y2BaHemi-methylated DNAgydF4y2Ba，比如在新一轮复制之后，也可以防止消化。限制性内切酶和修饰甲基化酶基因在宿主染色体或质粒DNA上彼此相邻，并可能以收敛、发散或顺序的方式在转录上定向。偶尔，在趋同或发散的基因组织中，编码内切酶表达调节因子的开放阅读框(通常称为对照或“C”基因)存在于内切酶基因的直接上游。由于内切酶和甲基化酶基因的接近性似乎是普遍的，它们通常被称为限制性内切酶/修饰(R/M)系统gydF4y2Ba^{（11）gydF4y2Ba}．III型酶使用改良的宿主保护机制gydF4y2Ba^{（12）gydF4y2Ba（13）gydF4y2Ba}．归巢内切酶是由可移动的、自我剪接的内含子或内含子编码的，没有相关的甲基化酶。gydF4y2Ba

C.识别序列gydF4y2Ba

大多数限制性内切酶识别回文或部分回文位点。回文被定义为围绕一个轴的二分体对称。例如，EcoRI:gydF4y2Ba

一组单字母代码已被接受用于部分回文的简并，如下所示:gydF4y2Ba

R = A或GgydF4y2Ba	K = G或TgydF4y2Ba	S = G或CgydF4y2Ba
Y = C或TgydF4y2Ba	M = A或CgydF4y2Ba	W = A或TgydF4y2Ba
B = not A (C或G或T)gydF4y2Ba	H = not G (A或C或T)gydF4y2Ba	N =任何核苷酸gydF4y2Ba
D = not C (A或G或T)gydF4y2Ba	V = not T (A或C或G)gydF4y2Ba

StyI的识别站点被列为CCWWGG。因此，StyI的底物序列可以是回文的(CCgydF4y2Ba助教gydF4y2BaGG或CCgydF4y2Ba在gydF4y2BaGG)或部分回文(CCgydF4y2BaTTgydF4y2BaGG或CCgydF4y2BaAAgydF4y2BaGG)。这种识别的灵活性或模糊性目前还没有被理解。允许的核苷酸既可以是嘌呤也可以是嘧啶，或者只排除一个核苷酸的情况特别有趣。中断的回文可以在所需的侧边核苷酸之间包含1到9个未指定的核苷酸。二部识别序列中断，但在指定的核苷酸中没有回文对称。非回文通常是指不对称的不间断序列，或者最多是序列中一个未指定的核苷酸。除I型、IIb型、ii型和III型外，裂解通常发生在识别位点内。在识别序列之外进行切割时，切割位置通常用符号(N)表示。gydF4y2Ba_xgydF4y2Ba其中X是该链识别序列3´端与切割位点之间未指定核苷酸的数量。如果只给出了一条链，然后是(X/Y)， X的含义与之前相同，Y是识别序列的5´端与互补链的切割位点之间未指定的核苷酸的数量。等裂体是识别相同序列并在相同位置裂解的内切酶。新分裂细胞识别相同的序列，但在该序列中的不同位置裂解。gydF4y2Ba

D.限制性内切酶的类型和一般性质gydF4y2Ba

下表给出了限制内切酶的类型和一般性质。上面的链的顺序是从5´到3´。箭头表示乳沟。一般来说，当识别位点是回文时，有一个单体伴甲基化酶。对于BcgI，唯一提出了结构的IIb型酶，甲基化活性与异源三聚体内的限制性内切活性包含在相同的亚基中gydF4y2Ba^{（4）gydF4y2Ba}．AdoMet，也被称为s -腺苷蛋氨酸，或SAM，总是需要甲基化。对于非回文识别位点，可能有一个或两个(链特异性)单体伴甲基化酶。内含子或内含子编码的酶没有相关的甲基化酶。gydF4y2Ba

限制性内切酶的类型和一般性质gydF4y2Ba

第II类(EC 3.1.21.4)gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba回文或间断回文，可能允许有歧义gydF4y2Ba（4）gydF4y2Ba 亚基结构gydF4y2Ba(1）gydF4y2Ba(限制活动):gydF4y2Ba为gydF4y2Ba（3）gydF4y2Ba(2 r)gydF4y2Ba 代数余子式gydF4y2Ba（2）gydF4y2Ba和催化剂:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba定义，在识别部位，可能导致3´突出，5´突出，或钝端。例如:EcoRI:gydF4y2Ba G / C AATTgydF4y2Ba C TTAA / GgydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaEcoRI, BamHI, HindIII, KpnI, NotI, PstI, smi, XhoIgydF4y2Ba

IIb型gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba一式两份的,中断gydF4y2Ba 亚基结构限制活动):gydF4y2Ba异质三聚体(2 R-M, 1 S)gydF4y2Ba 代数余子式gydF4y2Ba和催化剂:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba， AdoMet(用于甲基化)gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba将识别点两侧的两条线切割成一个明确的、对称的、短距离的距离，并留下3´的悬垂。gydF4y2Ba 例如:BcgI:gydF4y2Ba /gydF4y2Ba10gydF4y2Ba排气口(N) (N)gydF4y2Ba6gydF4y2BaTCG (N)gydF4y2Ba12gydF4y2Ba/gydF4y2Ba /gydF4y2Ba12gydF4y2Ba(N) GCT (N)gydF4y2Ba6gydF4y2BaACG (N)gydF4y2Ba10gydF4y2Ba/gydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaBcgI, Bsp24I, BaeI, CjeI, CjePIgydF4y2Ba

型国际教育协会gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba回文的，有歧义的回文的，或非回文的gydF4y2Ba 亚单元结构(限制活动):gydF4y2Ba同型二聚体(2r - s)或单体(R-S)，类似于II型或IIs型gydF4y2Ba 代数余子式gydF4y2Ba和催化剂:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba，也有二次认可网站，代理在gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba或gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba作为变构效应物与核酸内切酶结合(链接到术语表定义)gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba在识别点内或短距离内以确定的方式切割。激活剂DNA可能是完全裂解所必需的。例如:NaeI:gydF4y2Ba GCC / GGCgydF4y2Ba CGG / 20gydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaNaeI, NarI, BspMI, HpaII, SalI, EcoRII, Eco57IgydF4y2Ba(6）gydF4y2Ba， AtuBI, Cfr9I, SauBMKI, Ksp632IgydF4y2Ba

IIs类型gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba非回文的，几乎总是连续的，没有歧义gydF4y2Ba 亚单元结构(限制活动):gydF4y2Ba单体的(r)gydF4y2Ba 代数余子式gydF4y2Ba和催化剂:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba以确定的方式切割，且至少有一个切割位点在识别序列之外。很少留下钝头。gydF4y2Ba 例如:FokI:gydF4y2Ba GGATG (N)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba/gydF4y2Ba CCTAC (N)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba/gydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaFokI, Alw26I, BbvI, BsrI, EarI, HphI, MboII, SfaNI, Tth111IgydF4y2Ba

类型:内含子或内含子编码gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba12-40bp，存在碱基对替换公差gydF4y2Ba 亚单元结构(限制活动):gydF4y2Ba可能需要单体、同二聚体、其他蛋白质或RNAgydF4y2Ba 代数余子式gydF4y2Ba和催化剂:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba，也可以结合ZngydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba 留下3´和5´的1-10个基。一些地点尚未确定。其中一条链可以优先裂解，也可以在没有Mg的情况下裂解gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba．有些酶只裂解一条链。示例(拆分两条线):I-PpoI。gydF4y2Ba CTCTC TTAA / GGTAGCgydF4y2Ba GAGAG / AATT CCATCGgydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaI-PpoI i - ceeui I-DmoI I-SceI PI-SceI PI-PspIgydF4y2Ba

I型和III型酶gydF4y2Ba．gydF4y2Ba 下面列出的酶目前还没有上市。已知的I型和III型酶的数量非常有限，所有成员都被列出了。这两种类型都需要ATP。gydF4y2Ba 这两种类型的伴生甲基化酶亚基结构有几种可能。gydF4y2Ba

第I类(EC 3.1.21.3)gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba一式两份的,中断gydF4y2Ba 亚单元结构(限制活动):gydF4y2Ba通常为五聚络合物(2r, 2m，和1s)gydF4y2Ba 辅因子和激活因子:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba， AdoMet, ATP(水解)gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba距离识别地点远而多变。例如:EcoKI漂亮:gydF4y2Ba AAC (NgydF4y2Ba6gydF4y2BaGTGC (N)gydF4y2Ba＞400gydF4y2Ba）/gydF4y2Ba TTG (NgydF4y2Ba6gydF4y2BaCACG (N)gydF4y2Ba＞400gydF4y2Ba）/gydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaEcoKI, EcoAI, EcoBI, CfrAI, StyLTII, StySPIgydF4y2Ba

类型:III (EC 3.1.21.5)gydF4y2Ba

识别序列:gydF4y2Ba地说不是一个回文gydF4y2Ba 亚单元结构(限制活动):gydF4y2BaR和M-S都需要gydF4y2Ba 辅因子和激活因子:gydF4y2Ba毫克gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba, AdoMetgydF4y2Ba(7）gydF4y2Ba，gydF4y2BaATP(未水解)gydF4y2Ba（8）gydF4y2Ba，gydF4y2Ba可能需要第二个未修改的地点在相反的方向，可变的距离gydF4y2Ba（9)gydF4y2Ba 裂解位点:gydF4y2Ba从识别序列中切割大约25个碱基，可能无法切割到完成。例如:EcoP15I:gydF4y2Ba CAGCAG (N)gydF4y2Ba25日至26日gydF4y2Ba/gydF4y2Ba GTCGTC (N)gydF4y2Ba25日至26日gydF4y2Ba/gydF4y2Ba 示例(s):gydF4y2BaEcoP15I, EcoPI, HinfIII, StyLTIgydF4y2Ba

^1gydF4y2BaR、M和S是指限制性内切酶、甲基转移酶和底物特异性结构域，它们可以作为单独的亚基(R、M、S)存在，也可以在单个多肽中组合(R-S、M-S、R-M)。在II型系统的情况下，限制性内切酶和甲基转移酶特异性域的主要序列表现出很少的同源性，如果有的话。gydF4y2Ba

^2gydF4y2Ba虽然表现出对Mg的强烈偏好gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，其他二价金属可以替代，通常是MngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}但也CogydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}、铁gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}、镍gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，和ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}．然而，特异性可能减弱，解理率显著降低。gydF4y2Ba

^3.gydF4y2BaAatII(14)和SfiI(15)被报道为同四聚体。gydF4y2Ba

^4gydF4y2BaDpnI是唯一一种已知的I型、II型或III型酶，它需要6-甲基腺嘌呤在GATC的识别位点上才能活性。gydF4y2Ba

^5gydF4y2Ba存在许多等分裂体，它们是常见的II型。gydF4y2Ba

^6gydF4y2BaEco57 I已被分为IIe型(6)、IIs型(8)和迄今为止唯一的新分类成员IV型(16)。AdoMet被认为是刺激性的，但不是Eco57I所必需的，类似于III型酶。gydF4y2Ba

^7gydF4y2BaAdoMet被认为是对所有III型酶的刺激，但不是必需的(10)。gydF4y2Ba

^8gydF4y2Ba先前报道的ATP酶活性与I型酶切活性相比<1%，因此ATP被认为是辅助因子而不是底物。然而，最近有关EcoP15I的证据(12)表明，有必要更密切地研究III型限制酶活性的可能的atp酶活性。gydF4y2Ba

^9gydF4y2Ba在EcoP15I的宿主保护机制中，DNA在完全保护状态下被半甲基化，新复制的DNA受到保护，这是因为切割需要第二个收敛定向的、完全未修饰的位点。这种宿主保护机制可能也适用于其他Type III系统(EcoPI、HinfIII和StyLTI[12,13])。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

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回到顶部gydF4y2Ba

在限制性内切/修饰系统中，核酸酶和甲基化酶之间几乎没有氨基酸序列同源性，甚至在负责识别的区域之间也是如此。在限制性内切酶中，从同一属的细菌中分离出来的精确等分裂体除了参与催化的有限的PD…D/EXK基序外，在甲基化敏感性、消化优化或初级序列方面几乎没有相似之处。然而，这种共同的主题已经在gydF4y2BaII型，IIb型，IIe型，IIs型gydF4y2Ba而在gydF4y2Ba内含子编码限制性内切酶gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba（2）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

尽管缺乏初级序列同源性，II型同二聚体之间的三维结构与那些有晶体学数据的酶相似。总的来说，全酶二聚体呈“U”形，每边组成一个单体，其中包含识别和催化结构域，底部有一个重叠的桥接结构域。DNA结合在两个亚基之间。FokI是研究最多的IIs型酶，似乎主要作为单体存在，但在识别位点瞬时形成类似的二聚体gydF4y2Ba^{（3）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

限制性内切酶能特异性和非特异性结合dsDNA。在非同源序列结合后，一些酶已被证明通过线性扩散来定位它们的目标。例如，EcoRI以大约7 x 10的速率沿线性DNA扩散gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba英国石油公司的年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba（4）gydF4y2Ba}EcoRV扩散速率约为1.7 x 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba英国石油公司的年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba}．在这个过程中，大量的水分子似乎填满了酶和DNA之间的空间。一旦发现同源(识别)序列，由于酶与DNA的碱基和磷酸二酯主干之间的高度冗余接触，大部分水被排除在外。在EcoRI的情况下，50个水分子被排除在同源位点gydF4y2Ba^{(6）gydF4y2Ba}．一般情况下，目标序列两侧需要2-3个非特异性碱基才能正确识别。构象变化发生在酶和DNA作为特定的复合物形式。由此产生的诱导配合将催化中心定位在靠近底物的反应位置。对于迄今为止所研究的大多数酶来说，这在缺乏镁的情况下能够发生gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

利用已知的酶与同源序列结合的共晶体结构，以及在酶或DNA中对有限数量的额外酶的替代实验，假设了DNA切割的机制。迄今为止研究的大多数酶的证据都支持底物辅助催化模型gydF4y2Ba^{(7）gydF4y2Ba}．在该模型中，催化位点上的保守氨基酸与Mg结合gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}把它放在gydF4y2Ba易裂开的磷酸gydF4y2Ba．水解始于活化水分子的亲核攻击。磷酸的磷酸3´已被证明在催化作用中起一定作用，最有可能在活化水中起作用，因为甲基膦酸盐大大减少了裂解发生gydF4y2Ba^{（8）gydF4y2Ba}或phosphothioategydF4y2Ba^{（9)gydF4y2Ba}占据这个位置。一个保守的赖氨酸和/或MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}也可能参与活化水和稳定五价过渡态产生的分裂磷gydF4y2Ba^{（10）gydF4y2Ba}．当3´-OH离去基被一个Mg质子化时发生反转gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}出口时被束缚的水。gydF4y2Ba

不管作用机制如何，所有的限制性内切酶都有两个共同的特征，都需要MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}以及5´-磷酸和3´-OH产物。leyu乐鱼网一些酶可能还需要AdoMet或ATP，和/或将第二个识别序列结合到酶的变构位点上，作为裂解的必要条件或刺激因素。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

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9. Jeltsch,。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1993)gydF4y2BaEcoR I和EcoR V限制性内切酶在DNA裂解中的底物辅助催化作用gydF4y2Ba美国国立自然科学研究院。gydF4y2Ba90gydF4y2Ba, 8499 - 503。gydF4y2Ba
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大约3000种已知的限制性内切酶对其>200种不同目标序列的精确特异性可以被认为是它们最有趣的特征。尽管所有的限制性内切酶都是非特异性结合DNA的，但在最佳条件下，同源位点和次优位点(单碱基取代)的切割率差异非常大。例如，EcoRI在同源位点(5´-GAATTC-3´)和次优位点(5´-TAATTC-3´)的比率差异为10gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba(1）gydF4y2Ba}．同样，对于EcoRV，其同源位点(5´-GATATC-3´)的裂解为10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba比第二好的站点快一倍(5´-GTTATC-3´)gydF4y2Ba^{（2）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

然而，在非最优条件下，许多酶的同源位点和次优位点之间的裂解率差异发生了巨大变化。这种保真度的丧失或在类似同源位点的位点切割的增加通常被称为gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba．一些反应参数可以增加恒星位点相对于同源位点的裂解速率。这些包括pH值，存在的离子类型，离子强度，除Mg之外的金属辅助因子gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，高DNA:酶比和体积排除物(甘油，乙二醇等)的存在。随着恒星活动的增加，同源位点的解理速率一般会降低。例如，对于EcoRI，当乙二醇浓度增加到4M时，同源位点和星形位点之间的速率差接近于零gydF4y2Ba^{（3）gydF4y2Ba}而对于EcoRV, Mn时的速率差仅为6倍gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}取代MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba（2）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

对恒星活动的几种合理解释是基于所提出的目标位点识别和水解机制(见gydF4y2Ba结构和作用机制gydF4y2Ba以获取更多信息)。在非特异性结合过程中，大量的水分子存在于蛋白质- dna界面。当识别目标序列后，催化位点发生更紧密的结合和定位时，这些界面水分子的数量显著减少。体积排除物引起的较高渗透压导致界面水分子数量的同样减少，并使恒星位点更容易形成活性复合物gydF4y2Ba^{（3）gydF4y2Ba}．在碱性pH下，OH较高gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba浓度可能会减少对活化水分子的需求，活化水分子通常会对易分裂的磷发起亲核攻击。锰gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}对氧配体的亲和力比MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}并且可能更容易结合到部分活性构象的恒星位点的催化位点。也有可能MngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}束缚水能更好地使离去基质子化，因为它的pK更低gydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}比毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}束缚水gydF4y2Ba^{（4）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

尽管在4M乙二醇这样的极端条件下，所有的限制性内切酶在同源位点和近同源位点之间的裂解率差异可能会有所降低，但在一般使用条件下，大多数限制内切酶不会受到显著影响。那些易受恒星活动影响的分子，在不同程度上受到反应条件变化或上述条件组合的诱导。下表列出了Promega销售的酶，这些酶可能表现出恒星活性，特别是在反应条件偏离推荐的情况下。在多酶消化或多步骤应用中，建议尽可能保持或接近这些酶的最佳条件。gydF4y2Ba

可能表现出恒星活动的Promega酶。gydF4y2Ba

BamHIgydF4y2Ba	HindIIIgydF4y2Ba	PstIgydF4y2Ba	SgfIgydF4y2Ba
BclIgydF4y2Ba	KpnIgydF4y2Ba	萨利·gydF4y2Ba	SphIgydF4y2Ba
EcoRIgydF4y2Ba	心好gydF4y2Ba	脊髓gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

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3. 罗宾逊，C.R.和斯莱格，S.G. (1998)gydF4y2BaDNA结合和裂解过程中的溶剂化变化对EcoRI内切酶特异性的改变至关重要。gydF4y2BaProc。国家的。学会科学。美国gydF4y2Ba95gydF4y2Ba, 2186 - 91。gydF4y2Ba
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当出现多个侧翼序列不同的识别位点时，大多数限制性内切酶表现出轻微的偏好，并以不同的速度切割这些位点。这些速率差异是这样的，添加少量过量的酶将避免由于不完全消化而引起的任何问题。然而，像往常一样，人们必须意识到相对于单位定义的识别位点和消化条件的实验摩尔浓度。看到gydF4y2Ba衬底的考虑gydF4y2Ba获取更多信息。gydF4y2Ba

A. IIe型限制酶gydF4y2Ba

一些限制性内切酶在切割它们的某些识别位点时有相当大的困难。对这些酶的原始实验导致了它们的位置偏好的指定，如下所示:gydF4y2Ba

限制性内切酶位点偏好gydF4y2Ba
劈得开的网站gydF4y2Ba	>90%裂解，1-5倍过量酶gydF4y2Ba
缓慢的网站gydF4y2Ba	5-90%解理，超过1-5倍，额外解理超过10-30倍gydF4y2Ba
耐药的网站gydF4y2Ba	<5%，酶量5倍，无酶量10-30倍gydF4y2Ba

在相同或不同的dna中具有可切割、缓慢和耐切割位点的酶被指定为IIe型限制性内切酶。该组由酶组成，否则将是常见的II型或II型类的成员。IIe型酶包括NaeI、NarI、BspMI、HpaII、SacII、EcoRII、AtuBI、Crf9I、SauBMKI和Ksp632IgydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}．有证据表明Eco57I也属于这一类gydF4y2Ba^{（2）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

B.效应器序列gydF4y2Ba

调查发现，绑定的第二个识别序列，在gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba或gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba，到酶上的远端非催化位点，允许缓慢和抗性位点成为可切割的。egydF4y2BaffectorgydF4y2Ba序列以两种方式之一改变动力学。在K类(NarI, HpaII, SacII)中，激活剂DNA结合降低KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba不改变VgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}说明协同结合引起构象转移，从而增加酶对底物的亲和力。在V类(NaeI, BspMI)中，激活剂DNA的结合增加了VgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}不改变KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba说明催化活性的增加与酶对底物的亲和力无关。假设识别位点的侧翼序列影响该位点的裂解动力学，但此时相互作用尚不清楚。效应子序列刺激卵裂的能力也存在相当大的差异。一般来说，识别位点两侧的序列从一个容易切割的位点是一个有用的起点设计良好的效应器序列。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

1. 轮胎式压路机,境gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1991)gydF4y2BaDNA和亚精胺影响几种细菌限制性内切酶活性的能力。gydF4y2Ba生物化学。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba, 2543 - 9。gydF4y2Ba
2. 路透社,M。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1993)gydF4y2Ba利用特定的寡核苷酸双核苷酸，通过限制性内切酶刺激难解DNA位点的裂解。gydF4y2Ba分析的物化学。gydF4y2Ba209gydF4y2Ba, 232 - 7所示。gydF4y2Ba

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每种限制性内切酶都有最佳的反应(测定)条件和不同的长期储存条件。推荐的测定方法和储存条件均由制造商确定，为用户提供每种酶的最高活性、最佳保真度和最大稳定性。必须考虑的因素包括温度、pH值、酶辅助因子、盐成分、离子强度和稳定剂。Promega限制酶gydF4y2Ba反应缓冲区gydF4y2Ba旨在提供最佳活动和便利性的最佳平衡。Promega存储缓冲器经过加速和实时/实时温度稳定性实验设计。所有酶的储存条件都通过我们的质量保证再分析程序进行验证，以最大限度地提高长期稳定性。gydF4y2Ba

用一种限制性内切酶建立消化相对简单。然而，使用具有不同缓冲要求的多种酶的消化可能需要使用替代缓冲，并可能需要调整所用酶的单位数。参见参考表格gydF4y2BaPromega 10X缓冲液中限制酶的相对活性gydF4y2Ba或使用gydF4y2Ba限制性内切酶交互式搜索工具gydF4y2Ba．如果找不到相容的缓冲液，则可以进行顺序反应，其中在第二种酶之前向反应中添加额外的缓冲液或盐，或者可以使用最佳缓冲液依次进行每次消化。后一种选择将需要在第一次消化后进行DNA沉淀或纯化步骤。无论进行何种类型的消化，建议添加牛血清白蛋白以稳定酶并增强活性gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba（2）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

A.反应条件gydF4y2Ba

pH值:gydF4y2Ba大多数限制性内切酶在孵育温度下测量的pH值7.2和pH值8.5之间使用。pH值超出最佳范围可能导致gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

毫克gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba市售限制性内切酶需要镁gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}作为唯一的余子式。限制性内切酶活性对Mg相对不敏感gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}浓度;从5-30mM观察到类似的速率。其他二价金属离子的存在，尤指MngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}，可能导致gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

盐浓度:gydF4y2Ba限制性内切酶对离子强度的反应各不相同。大多数是50-150mM NaCl或KCl刺激的，而其他则是高于20mM的盐浓度抑制的。有些酶更喜欢醋酸离子而不是氯离子。次优的离子强度或离子类型可能导致gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

BSA:gydF4y2Ba牛血清白蛋白用于限制性内切酶储存缓冲液，并添加到消化反应中以稳定酶。BSA可以保护限制性内切酶免受蛋白酶、非特异性吸附和有害环境因素(如热、表面张力和干扰物质)的影响。通常，添加0.1mg/ml BSA将导致酶活性增强1.5至6倍。Promega的限制性内切酶提供的乙酰化牛血清白蛋白已经过修改和广泛测试，以确保不存在降解活性。gydF4y2Ba

甘油:gydF4y2Ba将甘油添加到限制性内切酶储存缓冲液中，以防止在-20°C冻结。限制性内切酶的反复冷冻/解冻会降低其活性。一些限制性内切酶特异性降低，或升高gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba，当最终反应中的甘油浓度高于5%时，尽管许多在甘油浓度高达10%时具有正常特异性。gydF4y2Ba

孵化温度:gydF4y2Ba大多数限制性内切酶在37°C时活性最高。一些酶需要较高或较低的温度才能达到最佳活性(例如TaqI, 65°C;SmaI 25°C)。对于高温酶孵育超过1小时，用一滴矿物油覆盖反应，以防止蒸发。一般来说，酶的孵育温度反映了源自该酶的菌株的生长温度。对于37°C以外的最佳温度的酶，Promega在每种酶包装的产品信息表上提供37°C下的活性百分比信息。这种类型的信息在执行双重摘要时特别有用。gydF4y2Ba

体积:gydF4y2Ba粘性DNA溶液可以抑制酶的扩散，降低酶的活性。DNA浓度过稀会低于KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba限制酶的活性，也会影响酶的活性。体积的考虑必须考虑到最终的离子强度，并且必须使甘油浓度不高于5-10%，以避免恒星活动。建议反应量为每微克DNA 10-50µl。gydF4y2Ba

B.单限制性内切酶消化gydF4y2Ba

根据单位定义，分析限制性内切酶反应通常在0.2-1.5µg底物DNA上进行，体积约为20µl，使用超过DNA 2- 10倍的酶。使用异常大量的DNA或酶可能会得到异常的结果。应谨慎，以防止高于正常浓度的EDTA和甘油。下面是一个典型的分析性单酶切的例子:gydF4y2Ba

1. 在无菌条件下，按规定的顺序将以下组件添加到无菌微量离心管中。gydF4y2Ba
   

   无菌，无核酸酶的水gydF4y2Ba	14µlgydF4y2Ba
   限制性内切酶10X缓冲液gydF4y2Ba	2µlgydF4y2Ba
   BSA，乙酰化(1mg/ml)gydF4y2Ba	2µlgydF4y2Ba
   DNA样品0.2-1µg，水或TE缓冲液gydF4y2Ba	1µlgydF4y2Ba
   限制性内切酶2-10UgydF4y2Ba	1µlgydF4y2Ba
   最后一卷gydF4y2Ba	20µlgydF4y2Ba

2. 用移液轻轻地混合。在12000 x下短暂离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在微型离心机中收集管子底部的内容物。gydF4y2Ba
3. 在最佳温度下孵育1-4小时。gydF4y2Ba
4. 加入4 μ l蓝色/橙色6X负载染料(或其他适当的DNA负载缓冲液)，并进行凝胶分析。gydF4y2Ba

更大规模的限制性内切酶消化可以通过按比例缩放这个基本反应来完成。gydF4y2Ba

C.多重限制性内切酶消化gydF4y2Ba

如果一个多重酶切体中的所有限制性内切酶都有相同的最佳缓冲，那么建立酶切体就很简单了。然而，当情况并非如此时，有几个选项是可用的。gydF4y2Ba

1. 如果在同一缓冲液中第二种酶的活性是可接受的，则使用由一种酶提供的最佳缓冲液。另外，两种酶的可接受活性可以通过使用Promega的另一种4-CORE®10X缓冲液(gydF4y2Ba猫。# R9921gydF4y2Ba)．如果其中一种酶在所选缓冲液中的活性低于75%，则可能需要增加反应时间或所用酶的单位数。注意可能发生的事情gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba在非最佳反应条件下(见参考表)gydF4y2BaPromega 10X缓冲液中限制酶的相对活性gydF4y2Ba或使用gydF4y2Ba限制性内切酶交互式搜索工具gydF4y2Ba识别兼容缓冲区)。gydF4y2Ba
2. 选择具有更多兼容缓冲要求的等裂体或新裂体。gydF4y2Ba
3. 用第一种酶进行单次消化，然后灭活该酶。加入第二次消化所需的原料，然后加入第二种酶。例如，首先使用低盐缓冲液和酶，然后使第一种酶失活，加入足够的盐以达到第二次消化所需的浓度，然后加入第二种限制性内切酶。gydF4y2Ba

注意:gydF4y2Ba使用最佳缓冲区按顺序执行每个摘要。这将需要在第一次消化后进行DNA沉淀或纯化步骤。虽然这个程序涉及的步骤比上面列出的要多，但在选项1-3不令人满意的情况下，它可能是最好的选择。gydF4y2Ba

D.实验控制gydF4y2Ba

一些常用控件用于gydF4y2Ba限制酶消化gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba凝胶分析gydF4y2Ba载于下表。gydF4y2Ba

限制性内切酶反应控制gydF4y2Ba
限制性内切酶消化控制gydF4y2Ba
对照:未经处理的DNA对照gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
DNA被装载在凝胶上，除了添加装载缓冲液外，没有任何处理。gydF4y2Ba	显示了DNA起始物质的完整性。在未经处理的样品中，质粒DNA通常呈缺口状、线状和超螺旋状。gydF4y2Ba
控制:gydF4y2Ba无酶控制gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
模拟文摘与实验文摘并行进行，只是没有添加酶。缺失的体积由水弥补。gydF4y2Ba	比较有酶和没有酶的DNA消化。检测可能独立于酶发生的变化，如DNA或其中一个反应组分中的外切酶污染。gydF4y2Ba
控制:gydF4y2Ba酶活性检查gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
使用单元定义DNA(通常是lambda)和Promega Product Information表中描述的条件执行控件摘要。gydF4y2Ba	证实了酶活性。gydF4y2Ba
对照:DNA底物对照和一般酶消化对照gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
设置以下并行摘要:gydF4y2Ba 按照酶的单元定义所述进行消解，但使用实验衍生的DNA而不是对照DNA。根据调整酶单位的数量gydF4y2Ba识别点密度gydF4y2Ba．gydF4y2Ba 执行实验提取，用相同数量的商业质量DNA(通常是lambda DNA)替换实验DNA。根据调整酶单位的数量gydF4y2Ba识别点密度gydF4y2Ba．gydF4y2Ba	比较了标准DNA和标准条件下的实验DNA在实验条件下的酶活性。检测底物DNA可能存在的问题，如杂质、缺失识别位点、甲基化等。可用于测定酶消化中使用的其他试剂的功能。如果怀疑DNA溶液中存在抑制剂，也可以进行一组比较实验DNA、对照DNA和两者组合的消化。在大多数情况下，当两者结合使用时，抑制剂的存在将“毒害”对照反应。gydF4y2Ba
凝胶分析控制gydF4y2Ba
对照:1个分子量标记物gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
电泳凝胶的一个或两个通道应始终用于尺寸标准，并用于与未知物进行比较。gydF4y2Ba	这保证了一个标准存在于:gydF4y2Ba 测定样品在凝胶中运行的距离。gydF4y2Ba 测量未知碎片的大小。gydF4y2Ba 反复看到熟悉的已知和标准化MW模式。gydF4y2Ba
对照:两种不同的MW标记gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
两个不同大小的标记比一个标记提供的信息要多得多。两组数据点在MW测量数据点的绘图过程中提供了更高的精度(通过与标准的迁移率进行比较)。如果使用两个标准，但它们迁移不同，也可以检测到车道之间的变化。gydF4y2Ba	更大范围的尺寸标准允许更准确的尺寸估计，并允许识别构象对迁移率和电泳变异性的影响。gydF4y2Ba 由于加载样品数量的差异而引起的异常迁移率也可以检测到。gydF4y2Ba
对照:在凝胶上加载两种不同数量的相同MW标记gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
每带质量控制:加载两个不同数量的相同大小的标记将产生由每带质量差异引起的迁移率变化的重要信息。gydF4y2Ba	允许检测移动的质量效应。在凝胶电泳过程中也可以显示车道与车道之间的变化。gydF4y2Ba
控制:盐效应控制gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
在不含或含实验消化盐的未知物旁进行标记。gydF4y2Ba	检测由于样品中存在高盐浓度而可能发生的任何凝胶延迟。gydF4y2Ba
对照:已知质量标记以稀释级数进行gydF4y2Ba
策略gydF4y2Ba	目的gydF4y2Ba
在标记巷和实验巷中选择相似MW的波段。将所讨论条带的质量与基于其染色强度的对照进行比较。为了达到最准确的视觉比较，许多稀释剂并排运行是至关重要的。gydF4y2Ba	未知DNA样本的数量可以用这种方法评估，或者用来确认分光光度法得到的结果。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

1. Williams, R.， Kline, M.和Smith, R. (1996) BSA和限制性内切酶消化。gydF4y2BaPromega笔记gydF4y2Ba59gydF4y2Ba, 46岁。gydF4y2Ba
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限制性内切酶的反应动力学不同。因此，应仔细考虑推荐的孵育时间、使用的单位数、底物量和/或总反应容积的变化，以确保完全消化。下表给出了Promega蓝/白克隆合格和基因组合格限制性内切酶在不同反应条件下的活性。使用的酶单位数目和反应孵育时间的变化进行了测试。在每种情况下，反应体积(50µl)和DNA底物的数量/类型(1µg)与单位定义测定中使用的相同。单位定义测定的孵育时间为1小时。gydF4y2Ba

非标准单位和培养时间条件下的限制性内切酶活性gydF4y2Ba
酶gydF4y2Ba	反应时间和使用的单位数gydF4y2Ba
	15分钟。gydF4y2Ba 4个单位gydF4y2Ba	15分钟。gydF4y2Ba 2单位gydF4y2Ba	15分钟。gydF4y2Ba 一个单位gydF4y2Ba	30分钟。gydF4y2Ba 2单位gydF4y2Ba	1小时gydF4y2Ba 一个单位gydF4y2Ba	2小时gydF4y2Ba 0.5个单位gydF4y2Ba	4人力资源gydF4y2Ba 0.25个单位gydF4y2Ba
ApaIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
BamHIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba
BclIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
BglIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
ClaIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
EcoRIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
EcoRVgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
HindIIIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
KpnIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
MluIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
NcoIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
NheIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
NotIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba
PstIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
尚驰gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
SacIIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
萨利·gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba
SmaIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
SpeIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba
SphIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba
XbaIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba
XhoIgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	我gydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba	CgydF4y2Ba

“C”表示完全裂解;“I”表示所示单位和孵育时间的不完全裂解。gydF4y2Ba

回到顶部gydF4y2Ba

A.基质来源和结构gydF4y2Ba

常用于酶切的底物包括噬菌体DNA、质粒DNA、基因组DNA、PCR产物和双链寡核苷酸。leyu乐鱼网DNA样品的浓度可以影响限制性消化的成功。粘性DNA溶液，由大量DNA在太小的体积中产生，可以抑制扩散，并可以显著降低酶的活性gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}．DNA浓度过低也可能抑制酶的活性gydF4y2Ba底物质量gydF4y2Ba)．典型的KgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba限制性内切酶的值在1nM到10nM之间，并依赖于模板gydF4y2Ba^{（2）gydF4y2Ba}．消化的最终推荐DNA浓度范围为0.02-0.2µg/µl。下面根据DNA类型讨论底物结构变化、浓度和特殊注意事项。gydF4y2Ba

λ背景:gydF4y2BaLambda DNA是线性DNA，是大多数限制性内切酶单位活性测量和表达的行业标准。一般情况下，在最佳反应条件下，在50µl的反应体积下，1个单位足以在1小时内切割1µg的lambda DNA。在DNA中gydF4y2Ba因为gydF4y2Ba末端(每个分子末端的12碱基互补单链悬垂物)可能在消化过程中重新退火。这会给人一种消化不完整的感觉。为了避免这个问题，在电泳之前将DNA在65°C下加热5分钟，以融化已经退火的两端。gydF4y2Ba

质粒:gydF4y2Ba圆形、超螺旋质粒DNA的大小一般在3-10kb之间。与线性DNA相比，质粒通常需要更多单位的限制性内切酶才能完全裂解gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}或要消化的站点总数(参见gydF4y2Ba识别地点密度gydF4y2Ba)．看到gydF4y2Ba超螺旋质粒DNA的消化gydF4y2Ba有关用常见克隆酶完全切割典型质粒载体所需的相对单位的信息。如果一个超螺旋质粒首先用另一种限制性内切酶线性化或用拓扑异构酶松弛，则可能需要更少的酶来消化。gydF4y2Ba

基因组DNA:gydF4y2Ba由于甲基化和黏性，基因组DNA的消化很困难。如果甲基化是一个问题，考虑使用具有不同甲基化敏感性的等分裂体(见gydF4y2Ba等裂体/新裂体对的甲基化敏感性gydF4y2Ba)．粘度可以通过增加反应体积来调节。当基因组DNA被稀释到每50-200µl 10µg的最低浓度时，它通常更有效地消化。如果不可能，把DNA加热到65度gydF4y2Ba^ºgydF4y2BaC前十分钟添加限制性内切酶可增强活性gydF4y2Ba^{（3）gydF4y2Ba}．据报道，在最终浓度为1-5mM的亚精胺中添加亚精胺也可以增加基因组DNA消化中的酶活性gydF4y2Ba^{（4）gydF4y2Ba}．在限制性消化中加入最终浓度为0.1mg/ml的牛血清白蛋白也可提高酶活性。gydF4y2Ba

PCR产leyu乐鱼网品:gydF4y2Bapcr扩增的DNA可以用在扩增序列或引物区域内具有识别序列的限制性内切酶消化。所需要的酶单位的数量必须与总位点的数量相平衡，以确保完全裂解。可能需要较长的孵育时间以确保完全消化。过度消化值低的酶(<12单位/16小时)应避免在夜间消化中使用，因为这些酶中存在的星活性或痕量污染物可能会导致问题。有关酶的过消化值，请参阅Promega产品信息表。对于许多常见的限制性内切酶，在PCR缓冲液中可以看到可接受的活性，尽管由于残留的聚合酶活性，扩增后的消化可能不会产生预期的兼容末端gydF4y2Ba^{（5）gydF4y2Ba}．接近PCR产物末端的消化也可能出现问题。限制性内切酶需要不同数量的侧翼DNA在识别位点周围，通常是1-3个碱基，但偶尔更多(见gydF4y2Ba线性DNA末端位点的消化gydF4y2Ba)．如果寡核苷酸引物设计的切割位点太接近DNA末端，该位点可能切割不良或根本不切割。由于很难检测DNA末端附近的切割，因此很难确定用额外的酶单位或增加孵育时间进行补偿的有效性。在PCR中使用校对酶也可能使情况复杂化，因为这些酶能够降解扩增子的3´端，干扰限制性内切酶的完全消化。使用高dNTP浓度并在PCR后立即冷却至4°C将减少这种降解。PCR片段不完全消化的另一个原因可能是引物二聚体。如果限制位点构建在引物中，引物二聚体将包含该位点的双链版本，通常比期望的目标PCR片段多出大量摩尔。这个问题可以通过使用Wizard®PCR Preps DNA纯化系统(gydF4y2Ba猫。# A7170gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

双链寡核苷酸:gydF4y2BaPCR产物的许多相同考虑适用于双链寡核苷酸的消化。leyu乐鱼网在这种情况下，每单位质量的高密度识别位点可以存在，该位点也可以靠近DNA分子的末端。同样，可能需要更长的消化时间和/或更多的酶。在夜间消化中应避免使用过度消化规格低(12单位/16小时)的酶。gydF4y2Ba

单链DNA:gydF4y2Ba尽管与双链DNA相比，单链DNA的裂解速率大大降低，但已有一些限制性内切酶的报道gydF4y2Ba^{(6）gydF4y2Ba}．然而，研究表明，一些似乎可以切割单链DNA的限制性内切酶实际上可以识别单链基因组中的折叠双工区域(例如，M13, f1，单链phiX174)。gydF4y2Ba^{(7）gydF4y2Ba（8）gydF4y2Ba}．因此，这些酶不是消化单链DNA，而是消化双链形式的单个位点。gydF4y2Ba

dna rna杂交:gydF4y2Ba几种限制性内切酶(AluI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HindIII, MspI, SalI, ThaI)已经描述了DNA-RNA杂交分子的消化作用。gydF4y2Ba^{（9)gydF4y2Ba}．在这些情况下，杂交的DNA链在与双链DNA相同的地方被消化。消化所需的酶水平比双链DNA所需的酶水平高20至50倍。有可能，但尚未证明，RNA也被大量过量的酶裂解。gydF4y2Ba

侧翼顺序的影响:gydF4y2Ba限制性内切酶识别序列两侧的序列可以影响许多限制性内切酶的裂解率，尽管差异通常小于10倍。少数酶(如NaeI, HpaII, SacII, NarI, EcoRII)表现出更明显的位点偏好，被指定为IIe型。看到gydF4y2Ba站点偏好和Turbo™限制性内切酶gydF4y2Ba获取更多信息。gydF4y2Ba

甲基化:gydF4y2Ba限制性内切酶识别序列中的核苷酸甲基化会影响消化。甲基化可以在细菌(包括质粒)、真核生物及其病毒的DNA中以4-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或6-甲基腺嘌呤的形式发生。许多限制性内切酶对位点特异性甲基化的敏感性或缺乏敏感性是众所周知的gydF4y2Ba^{（10）gydF4y2Ba}．通常，等分裂体的甲基化敏感性不同。指gydF4y2Ba猫。# A1330gydF4y2Ba)提供了一种简单有效的方法来分离和纯化DNA，不含盐或大分子污染物。最终浓度为1mM的亚精胺和/或最终浓度为0.1mg/ml的BSA也可以改善质量差的miniprep DNA的消化。gydF4y2Ba

基因组DNA:gydF4y2Ba基因组DNA通常比质粒DNA含有更多的污染物。当吸光度比为AgydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba至少1.8。亚精胺可以添加到1mM的最终浓度，BSA可以添加到0.1mg/ml的最终浓度，以改善低质量基因组DNA的消化。有关更多信息，请参阅gydF4y2Ba高分子量DNA的消化gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

基因组DNA嵌入琼脂糖塞:gydF4y2Ba脉冲场凝胶电泳允许极大的DNA片段的分辨率。通过传统技术纯化的基因组DNA可能由于机械剪切力而含有双链断裂。这样的断点可以作为50-1000kb片段兆酶映射的背景源。为了避免这种情况，可以将哺乳动物、细菌和酵母细胞嵌入琼脂糖条中，然后用蛋白酶K溶解并处理细胞gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba^{（11）gydF4y2Ba}．只要使用更多的酶和更长的孵育时间，大多数限制性内切酶可以切割嵌入琼脂糖中的DNA。一个好的经验法则是每微克DNA使用5-10个单位的酶，避免使用过度消化值低的限制性内切酶(<20单位/16小时)，这会在长时间的过量酶培养中引起问题。有关更多信息，请参阅gydF4y2Ba高分子量DNA的消化gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

从血液中纯化的基因组DNA。gydF4y2Ba采血过程中使用的抗凝血剂会影响限制性内切酶完全消化DNA的能力。使用EDTA作为抗凝血剂而不是肝素，肝素会与酶紧密结合并干扰消化。A处的吸光度比gydF4y2Ba_260gydF4y2Ba/一个gydF4y2Ba_280gydF4y2Ba应该至少是1.8，说明蛋白质已经被有效去除。已经编写了许多快速DNA纯化方案，不需要从红细胞中分离白细胞gydF4y2Ba^{（12）gydF4y2Ba（13）gydF4y2Ba}．这些技术可以从少量血液中产生高质量的DNA，但扩大规模后获得的DNA质量可能较差。对于较大的血液样本，建议在DNA纯化之前使用从红细胞中分离白细胞的技术，例如通过Ficoll®梯度将红细胞制成颗粒。gydF4y2Ba

Promega提供Wizard®基因组DNA纯化试剂盒(gydF4y2Ba猫。# A1120)gydF4y2Ba用于从白细胞(使用去除红细胞的试剂/方案)、组织培养细胞、动物组织、植物组织以及革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中分离基因组DNA。用该系统纯化的DNA适用于限制性内切酶消化。gydF4y2Ba

PCR产leyu乐鱼网品:gydF4y2BaPCR中的污染物如盐、甘油和引物二聚体可以抑制限制性内切酶的活性。The Wizard®PCR Preps DNA纯化系统(gydF4y2Ba猫。# A7170gydF4y2Ba)提供了从任何盐或大分子污染物中纯化双链pcr扩增DNA的可靠方法。gydF4y2Ba

C.识别地点密度gydF4y2Ba

限制性内切酶活性单位通常是根据1µg lambda DNA的1小时消化来定义的。在消化其他底物时，可能需要根据底物的数量、每个分子的识别位点数量和孵育时间进行调整。下表说明了在保持底物质量和培养时间不变的情况下，EcoRI每个分子的底物识别位点差异的影响。gydF4y2Ba

EcoRI底物识别位点的差异gydF4y2Ba
DNA衬底gydF4y2Ba	基地gydF4y2Ba 双gydF4y2Ba	皮摩尔gydF4y2Ba 在1µg *gydF4y2Ba	减少网站gydF4y2Ba (EcoRI)gydF4y2Ba	皮摩尔gydF4y2Ba 减少网站gydF4y2Ba	单位gydF4y2Ba 需要gydF4y2Ba
单元定义(lambda)gydF4y2Ba	48502年gydF4y2Ba	0.0317gydF4y2Ba	5gydF4y2Ba	0.1585gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba
质粒gydF4y2Ba	3000年gydF4y2Ba	0．5gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0．5gydF4y2Ba	3 * *gydF4y2Ba
PCR片段gydF4y2Ba	700gydF4y2Ba	2．2gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	2．2gydF4y2Ba	14gydF4y2Ba
寡核苷酸gydF4y2Ba	25gydF4y2Ba	62.5gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	62.5gydF4y2Ba	394gydF4y2Ba

*基于650道尔顿每碱基对DNA。gydF4y2Ba
酶在消化超螺旋底物和线性底物的能力上有所不同。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

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回到顶部gydF4y2Ba

A.高分子量DNA的分离gydF4y2Ba

高分子量基因组DNA可以用几种不同的方法制备，包括传统的苯酚提取gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}，标准的分离程序，如Wizard®基因组DNA纯化试剂盒(gydF4y2Ba猫。# A1120gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{（2）gydF4y2Ba（3）gydF4y2Ba}或者通过将感兴趣的细胞嵌入琼脂糖块或珠子中，并通过酶的方式消化细胞膜和蛋白质gydF4y2Ba^{（4）gydF4y2Ba}．大的DNA非常容易受到机械剪切的影响，除非将其嵌入琼脂糖中，否则很难获得50kb或更多的DNA。无论采用何种制备方法，基因组DNA的纯度往往低于质粒或其他更小的DNA，在分离过程中可以更严格地处理。此外，基因组DNA，特别是高等生物的基因组DNA，可能包含更多的修饰，如甲基化。的gydF4y2Ba甲基化敏感性gydF4y2Ba可能需要考虑基因组消化的潜在限制性内切酶。过多的限制性内切酶单位和延长的孵育时间是基因组消化的标准。对于长时间的孵育，特别是在高温下，从缓冲液中蒸发的水可以集中反应的成分，并引起gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba．该反应可以覆盖矿物油或在培养箱中进行消化，以避免蒸发。最终浓度为1-5mM的亚精胺也被证明有助于基因组消化gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

对于溶液中的DNA，例如通过苯酚萃取或使用Wizard®Genomic DNA纯化试剂盒制备的溶液，粘度可能会限制溶液的混合和酶的扩散。一般情况下，在20 μ l的反应量中，建议每微克DNA使用2-10个单位的限制性内切酶。潜伏期一般为4小时至一整晚。gydF4y2Ba

下面提供了在琼脂糖中嵌入和消化哺乳动物细胞的一般方案。对于其他类型的细胞，条件会有显著不同。gydF4y2Ba

B.在琼脂糖凝胶塞中包埋哺乳动物细胞的程序gydF4y2Ba

1. 在500倍的离心下收集细胞gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。在等渗溶液中清洗细胞，并在同一溶液中重悬。计数细胞，稀释到适当的密度(~5 x 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞/ml)等张缓冲液。gydF4y2Ba
2. 在等渗缓冲液中制备1%低温琼脂糖，加热使琼脂糖融化，然后冷却至37℃。gydF4y2Ba
3. 将细胞悬浮液加热至37°C，与熔化的琼脂糖1:1混合，并分配到适当的模具中。最好把模具放在冰上，这样琼脂糖就会迅速凝结。这将减少细胞的沉降。gydF4y2Ba
4. 在塞子凝固后，将其从模具中取出，并将其置于1mg/ml pronase + 1%月桂基肌氨酸、0.5M EDTA和10mM Tris (pH 9.5)的溶液中。gydF4y2Ba
5. 将插头放在室温下的溶液中30分钟，以使pronase和缓冲液扩散到插头中。gydF4y2Ba
6. 50°C孵育过夜。更换缓冲液/pronase，在50°C下再孵育24小时。gydF4y2Ba
7. 在缓冲液中冲洗插头2小时，重复此冲洗步骤。储存在4°C。gydF4y2Ba

C.琼脂糖凝胶塞中高分子量DNA的消化gydF4y2Ba

消化琼脂糖嵌入DNA所需的条件不同于溶解DNA所需的条件。一般来说，需要更多的限制性内切酶。我们已经测试了一些酶消化嵌入琼脂糖的DNA的能力(见下表)。所需酶的确切数量取决于DNA类型和制备方法。下面提供了琼脂糖嵌入DNA消化的一般方案。gydF4y2Ba

协议gydF4y2Ba

1. 将琼脂糖塞浸泡在TE缓冲液(10mM Tris-HCl [pH 7.4]， 1mM EDTA)中，在冰上浸泡30分钟。gydF4y2Ba
2. 将塞子平衡在适当的限制性内切酶缓冲液中，补充20µg/ml的牛血清白蛋白，在冰上浸泡30分钟。gydF4y2Ba
3. 将限制性内切酶添加到每个管中(请参见下表中的适当酶用量示例)。让酶扩散到琼脂糖在冰上30分钟。gydF4y2Ba
4. 在适当温度下孵育反应3小时至一夜。gydF4y2Ba
5. 在最终浓度为60mM时加入EDTA以停止反应。gydF4y2Ba
6. 消化后的琼脂糖塞可在4°C保存数天，直至使用。gydF4y2Ba

用Promega基因组限定酶消化染色体DNA的参数gydF4y2Ba
		基因组gydF4y2Ba			消化条件gydF4y2Ba
PromegagydF4y2Ba 酶gydF4y2Ba	识别gydF4y2Ba 序列gydF4y2Ba	源gydF4y2Ba	大小gydF4y2Ba (Mb)gydF4y2Ba	G + CgydF4y2Ba （％）gydF4y2Ba	酶(u):gydF4y2Ba DNA(µg)gydF4y2Ba	Temp。gydF4y2Ba (°C)gydF4y2Ba	时间gydF4y2Ba (人力资源)gydF4y2Ba	的数量gydF4y2Ba 片段gydF4y2Ba
BclIgydF4y2Ba	T / GATCAgydF4y2Ba	n .菌gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	54gydF4y2Ba	30:2gydF4y2Ba	50 *gydF4y2Ba	15gydF4y2Ba	许多gydF4y2Ba
BglIgydF4y2Ba	GCCNNNN / NGGCgydF4y2Ba	金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba	3．0gydF4y2Ba	34gydF4y2Ba	30:2gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	20 - 25gydF4y2Ba
ClaIgydF4y2Ba	在/ CGATgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	12:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	4gydF4y2Ba	许多gydF4y2Ba
MluIgydF4y2Ba	A / CGCGTgydF4y2Ba	金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba	3．0gydF4y2Ba	34gydF4y2Ba	10:2gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	25 - 30gydF4y2Ba
NheIgydF4y2Ba	G / CTAGCgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	5:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	20 - 25gydF4y2Ba
NotIgydF4y2Ba	GC / GGCCGCgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	5:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	7gydF4y2Ba
萨利·gydF4y2Ba	G / TCGACgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	16:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	4gydF4y2Ba	»15gydF4y2Ba
SmaIgydF4y2Ba	CCC / GGGgydF4y2Ba	金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba	3．0gydF4y2Ba	34gydF4y2Ba	20:2gydF4y2Ba	22gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	18gydF4y2Ba
SpeIgydF4y2Ba	A / CTAGTgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	5:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	20 - 25gydF4y2Ba
XbaIgydF4y2Ba	T / CTAGAgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	10:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba	25 - 30gydF4y2Ba
XhoIgydF4y2Ba	C / TCGAGgydF4y2Ba	牛分枝杆菌gydF4y2Ba	2.9gydF4y2Ba	45gydF4y2Ba	16:1gydF4y2Ba	37gydF4y2Ba	4gydF4y2Ba	15 - 20gydF4y2Ba

*在矿物油下进行50°C消化。gydF4y2Ba

D.基因组复杂性和预期限制位点频率gydF4y2Ba

如果已知DNA的GC含量百分比和限制性内切酶的识别序列，就有可能计算出给定基因组DNA的预期平均片段大小。例如，在一个GC含量为50%且没有二核苷酸偏倚的基因组中，可以预期每4个切割一次4个gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba碱基(256)，六刀可以预期消化每4gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba(4096)个碱基，八刀应该消化每4个gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba(65536)基地。对于GC含量超过50%的序列，仍然可以通过考虑特定核苷酸出现在识别序列中每个位置的概率来进行计算。gydF4y2Ba

方程的一般形式为:gydF4y2Ba

预计切割频率= (0.5 x GC)gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}x (0.5 x AT)gydF4y2Ba^bgydF4y2Ba

“GC”和“AT”是给定碱基为(G或C)或(a或T)(目标DNA的GC或AT含量)的概率，“a”是限制性内切酶识别序列中G和C的数量，“b”是a和T的数量。gydF4y2Ba

例如，对于来自有机物的DNA的EcoRI消化(GAATTC)， GC含量为40%且无二核苷酸偏倚，预计切割的几率为:gydF4y2Ba

(0.5 x GC)gydF4y2Ba^{一个gydF4y2Ba}x (0.5 x AT)gydF4y2Ba^bgydF4y2Ba= (0.5 x 0.4)gydF4y2Ba^2gydF4y2BaX (0.5 X 0.6)gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba= 0.000324gydF4y2Ba

切割任意给定的6碱基序列的概率是0.000324，或者平均每3086个碱基切割一次。gydF4y2Ba

如果在被消化的DNA中，二核苷酸和三核苷酸重复序列的频率存在已知偏差，则可以细化方程gydF4y2Ba^{（5）gydF4y2Ba}．对于序列NgydF4y2Ba_1gydF4y2BaNgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_4gydF4y2BaNgydF4y2Ba_5gydF4y2BaNgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba(其中NgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba通过NgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba是否在酶切酶识别序列中的碱基)，预计消化的频率可以计算为gydF4y2Ba

p (NgydF4y2Ba_1gydF4y2BaNgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_4gydF4y2BaNgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_5gydF4y2BaNgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba) / p (NgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

其中p(N)是N在基因组中的频率p(NgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}NgydF4y2Ba_bgydF4y2Ba)为二核苷酸重复频率。gydF4y2Ba

或gydF4y2Ba

p (NgydF4y2Ba_1gydF4y2BaNgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_4gydF4y2BaNgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_4gydF4y2BaNgydF4y2Ba_5gydF4y2BaNgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba) / p (NgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_3.gydF4y2BaNgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba) p (NgydF4y2Ba_4gydF4y2BaNgydF4y2Ba_5gydF4y2Ba）gydF4y2Ba

p (NgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}NgydF4y2Ba_bgydF4y2Ba)为二核苷酸重复频率，p(NgydF4y2Ba_{一个gydF4y2Ba}NgydF4y2Ba_bgydF4y2BaNgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba)为三核苷酸重复频率。gydF4y2Ba

许多生物的GC含量和二核苷酸频率已被测定gydF4y2Ba^{(6）gydF4y2Ba}．由于许多生物的序列已经被阐明，现在有可能生成整个基因组的完整限制图。大多数完整的基因组序列都可以从万维网上获得，比如京都基因和基因组百科全书(KEGG): http://www.genome.ad.jp/kegg/java/org_list.htmlgydF4y2Ba

其他有用的网站包括:gydF4y2Ba

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMedgydF4y2Ba
• http://www.tigr.org/tdb/index.shtmlgydF4y2Ba

E.大片段DNA分析gydF4y2Ba

标准琼脂糖凝胶电泳可用于在~10bp(4%凝胶)到~50kb(0.3%凝胶)范围内解析DNA。脉冲场凝胶电泳(PFGE)是检测较大DNA片段的必要手段。PFGE依赖于在电场中DNA重新定向的速率与DNA片段的大小成正比的观察。在PFGE中，电场相对于凝胶的方向，因此DNA，在整个凝胶运行过程中发生变化。较大的dna重新定位的速度较慢，因此净迁移速率较慢。几种不同类型的PFGE包括:正交场琼脂糖凝胶电泳(OFAGE)、场反演凝胶电泳(FIGE)、旋转琼脂糖凝胶电泳(RAGE)和轮廓夹住均匀电场(CHEF)可用于此目的。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

1. 奥苏贝尔,F.M.gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1993)gydF4y2Ba分子生物学的最新进展gydF4y2Ba，卷1，格林出版公司，和约翰威利父子，纽约。221年,317年。gydF4y2Ba
2. 向导gydF4y2Ba®gydF4y2Ba基因组DNA纯化试剂盒技术手册gydF4y2Ba， TM050, Promega Corporation。gydF4y2Ba
3. 协议和应用指南，在线版。gydF4y2BaPromega公司。gydF4y2Ba
4. 阿南德，R.和南，E. (1990)gydF4y2Ba核酸凝胶电泳:一种实用的方法leyu体育靠谱吗gydF4y2Ba，第二版。瑞克伍德，D.，海姆斯，B.。IRL出版社，牛津，英国gydF4y2Ba
5. Perbal, B. (1998)gydF4y2Ba分子克隆实用指南gydF4y2Ba，约翰·威利父子，纽约。327.gydF4y2Ba
6. 麦克勒兰德,M。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1987)gydF4y2Ba细菌基因组脉冲场图谱的限制性内切酶。gydF4y2Baleyu体育靠谱吗核酸测定。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba, 5985 - 6005。gydF4y2Ba

回到顶部gydF4y2Ba

限制性内切酶单位通常使用包含多个识别位点的线性DNA底物来定义，因为这些底物往往会给出更可重复的结果。Lambda和腺病毒是使用最频繁的两种基质，因为它们的商业可用性和高质量。在适当的缓冲液和温度条件下，一个单位的酶是在一小时内完全消化1µg这样的DNA所必需的量。gydF4y2Ba

分子生物学应用经常涉及在多个克隆序列中的单个位点切割超螺旋质粒。通常，消化1µg质粒需要超过1单位的酶。有几个原因可以解释这种情况。例如，1µg的lambda中含有0.0317皮摩尔的DNA。HindIII在1µg中切割该底物7次或0.2219皮摩尔的识别位点。对于具有单个识别位点的3000碱基对质粒，1µg中有0.5皮摩尔的DNA和0.5皮摩尔的识别位点，是相同质量lambda DNA的两倍多。限制性内切酶在超螺旋质粒中通过线性扩散找到单个位点的能力也被认为不同于在线性底物上的任何位点。尽管这种情况并不常见，但某些酶在切割超螺旋DNA的能力上表现出差异，这取决于所使用的缓冲条件。例如，SacII在切割超卷曲质粒的能力上表现出明显的差异，这取决于缓冲条件，但这种敏感性在线性底物上并不明显。Promega的反应缓冲液C，配备SacII，适用于线性和超螺旋DNA底物。gydF4y2Ba

下表列出了完全切割包含单个识别位点的1µg超线圈pGEM®矢量所需的最小单元数。列出了常用的Promega限制性内切酶，包括所有蓝/白克隆合格的酶。gydF4y2Ba

切1µg含有单个限制位点的超卷曲DNA所需的酶的最小单位数gydF4y2Ba
酶gydF4y2Ba	最低gydF4y2Ba 单位gydF4y2Ba	酶gydF4y2Ba	最低gydF4y2Ba 单位gydF4y2Ba
ApaIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	心好gydF4y2Ba	4gydF4y2Ba
BamHIgydF4y2Ba	2gydF4y2Ba	NotIgydF4y2Ba	2gydF4y2Ba
BglIIgydF4y2Ba	2gydF4y2Ba	PstIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba
ClaIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	尚驰gydF4y2Ba	4gydF4y2Ba
EcoRIgydF4y2Ba	2gydF4y2Ba	SacIIgydF4y2Ba	20.gydF4y2Ba
EcoRVgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	萨利·gydF4y2Ba	5gydF4y2Ba
HindIIIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	SmaIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba
KpnIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	SpeIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba
MluIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	SphIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba
NcoIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	XbaIgydF4y2Ba	1gydF4y2Ba
		XhoIgydF4y2Ba	2gydF4y2Ba

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为了识别和切割它们的识别序列，大多数限制性内切酶需要一些侧翼DNA。因此，如果PCR产物的限制性内切位点位于引物末端附近，则很难实现完全消化，或者使用两种酶在多联子区彼此靠近的位点切割进行双消化。leyu乐鱼网这种消化可以通过长时间(16小时)孵育来改善。gydF4y2Ba

A.多重摘要gydF4y2Ba

当在一个多链接体区域内进行多个消化时，重要的是要确定位点是否重叠，以至于一个位点的裂解会破坏另一个位点。例如，下面的序列包含一个KpnI (GGTAC/C)和一个smi (CCC/GGG)位点。gydF4y2Ba

NNNNNGGTACCCGGGNNNNN…gydF4y2Ba
NNNNNCCATGGGCCCNNNNN…gydF4y2Ba

如果这个DNA首先被KpnI消化，它会留下下面的序列gydF4y2Ba不能gydF4y2Ba用smi消化。gydF4y2Ba

.．.NNNNNGGTAC CCGGGNNNNN...
.．.NNNNNCCATGGGCCCNNNNN...

或者，如果DNA首先用smi消化，它将留下如下所示的序列，可以用KpnI消化，尽管由于缺乏侧翼碱基可能会出现问题。gydF4y2Ba

.．.NNNNNGGTACCC GGGNNNNN...
.．.NNNNNCCATGGG CCCNNNNN...

考夫曼和埃文斯的研究gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba}莫雷拉和诺伦gydF4y2Ba^{（2）gydF4y2Ba}展示了多种酶对多联体区域的消化效率。这些数据可以用来帮助确定在最有效的多次消化中使用两种酶的顺序，或者预测酶在两次消化中是否有效。将这些出版物的结论应用于PCR产物的消化时必须小心，因为限制性内切酶留下的大多数末端有2-4个碱基3´或5´的悬垂。leyu乐鱼网通常，PCR产物要么是钝端(如leyu乐鱼网果使用校对耐热聚合酶)，要么包含单个3´悬垂碱基(如果使用非校对酶)。gydF4y2Ba

B. PCR产leyu乐鱼网物gydF4y2Ba

一般来说，在PCR引物的工程限制位点上游添加2-6个额外的碱基将大大提高扩增产物的消化效率，但这取决于所使用的酶。表2.6显示了一项研究的结果，该研究测试了限制性内切酶对各种PCR产物的消化能力leyu乐鱼网gydF4y2Ba^{（3）gydF4y2Ba}．对限制位leyu乐鱼网点的第一个碱基对与(0)或距离片段末端1、2或3个碱基对齐平的PCR产物，用多种酶进行检测。gydF4y2Ba

限制性内切酶切割片段末端有工程限制性内切位点的PCR产物的能力leyu乐鱼网gydF4y2Ba
酶gydF4y2Ba	距离PCR片段末端的距离(单位bp)gydF4y2Ba
	0gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	2gydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba
ApaIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
BamHIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
ClaIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
EcoRIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
EcoRVgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
HindIIIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
NotIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
PstIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
尚驰gydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
萨利·gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
SmaIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
SpeIgydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
XbaIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba
XhoIgydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	- - - - - -gydF4y2Ba	±gydF4y2Ba	+gydF4y2Ba

纯化的PCR片段(10-50ng)用0.5单位的限制性内切酶在10µl适当的反应缓冲液中消化至少两次，时间为45分钟。消化指示如下:可切割(+)，不可切割(-)，不可复制(±)。表格由伊顿出版公司授权转载。gydF4y2Ba

在PCR引物中添加上游碱基并不是提高消化效率的唯一方法。已经提出了许多改善消化的方案，包括蛋白酶K处理以去除任何可能阻塞DNA的耐热聚合酶，用Klenow或T4 DNA聚合酶进行末端抛光，以及添加亚精胺。然而，这些方法都没有被证明能显著提高克隆效率gydF4y2Ba^{（4）gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

在PCR引物中加入限制性内切酶位点的另一个缺点是很难从未切割的产物中分离出已消化的PCR产物。leyu乐鱼网这可以通过在PCR之前在引物的5´端添加荧光标记来克服。这可以识别已经成功切割的产品，因为标签在消化过程中丢失了leyu乐鱼网gydF4y2Ba^{(6）gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

另一种已成功用于改进PCR产物消化的方法是在扩增后将片段串联leyu乐鱼网gydF4y2Ba^{(1）gydF4y2Ba（5）gydF4y2Ba}．这是通过首先用T4多核苷酸激酶(如果引物尚未磷酸化)处理清除的PCR产物来实现的。leyu乐鱼网末端将会是钝的，如果一个校对耐热聚合酶，如gydF4y2Ba空斑形成单位gydF4y2Ba使用T4 DNA聚合酶或可能使用T4 DNA聚合酶处理来抛光末端，如果非校对聚合酶如gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba是使用。PCR产leyu乐鱼网物用T4 DNA连接酶连接。这有效地将限制性内切酶位点从片段的末端移开，并允许有效的消化。gydF4y2Ba

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参考文献gydF4y2Ba

1. 考夫曼，D.L.和埃文斯，G.A. (1990)gydF4y2BaPCR产物末端的限制性内切酶裂解。leyu乐鱼网gydF4y2Ba生物学技术gydF4y2Ba9gydF4y2Ba， 304, 306。gydF4y2Ba
2. 莫雷拉，R.F.和诺伦，C.J. (1995)gydF4y2Ba线性DNA片段末端附近限制性内切酶裂解的最低双工要求。gydF4y2Ba生物学技术gydF4y2Ba19gydF4y2Ba， 56, 58-9。gydF4y2Ba
3. 齐默尔曼,K。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1998)gydF4y2BaPCR产物末端限制性内切酶识别位点的消化。leyu乐鱼网gydF4y2Ba生物学技术gydF4y2Ba24gydF4y2Ba, 582 - 4所示。gydF4y2Ba
4. 荣格,V。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1990)gydF4y2Ba高效克隆PCR生成的含有末端限制性内切酶识别位点的DNA。gydF4y2Baleyu体育靠谱吗核酸测定。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba, 6156年。gydF4y2Ba
5. 荣格,V。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1993)gydF4y2Ba聚合酶链反应产生的含有末端限制性内切酶识别位点的DNA的克隆。gydF4y2Ba冰毒。Enzymol。gydF4y2Ba218gydF4y2Ba, 357 - 62。gydF4y2Ba
6. 山口,K。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(1994)gydF4y2Ba荧光引物可以直接确认PCR产物的限制性内切酶裂解。leyu乐鱼网gydF4y2Ba生物学技术gydF4y2Ba17gydF4y2Ba640 - 50,652。gydF4y2Ba

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本故障排除指南解决了在使用限制性内切酶时可能遇到的常见问题。如果问题仍然存在，请联系Promega技术服务gydF4y2Batechserv@promega.comgydF4y2Ba或800-356-9526(仅限美国和加拿大)。gydF4y2Ba

问题gydF4y2Ba：gydF4y2Ba没有乳沟gydF4y2Ba
可能的原因gydF4y2Ba	评论gydF4y2Ba
脏模板DNAgydF4y2Ba	使用Wizard®DNA清理系统(gydF4y2Ba猫。# A7280gydF4y2Ba)．或者，苯酚/氯仿萃取然后乙醇沉淀可以用来纯化DNA底物。gydF4y2Ba 基板质量和注意事项的讨论可以在gydF4y2Ba衬底的考虑gydF4y2Ba本指南的一部分。gydF4y2Ba
抑制剂的存在gydF4y2Ba	底物DNA溶液中的酶抑制剂(例如，SDS，苯酚，EDTA，氯仿，乙醇，CsCl，高盐，或微离心管中的增塑剂)可以使用Wizard®DNA清理系统去除。或者，苯酚/氯仿萃取和/或乙醇沉淀可用于从DNA制剂中去除抑制剂。gydF4y2Ba
DNA甲基化(例如:gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba，gydF4y2Ba扩张型心肌病gydF4y2Ba）gydF4y2Ba	检查gydF4y2Ba甲基化敏感性参考表gydF4y2Ba关于限制性内切酶对底物甲基化状态的敏感性的信息。gydF4y2Ba 对于质粒DNA，通过将DNA通过缺乏干扰甲基化酶的细菌宿主来消除甲基化。例如,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaJM110，两者都缺乏gydF4y2Ba大坝gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba扩张型心肌病gydF4y2Ba活动。gydF4y2Ba 使用对甲基化不敏感的等裂体消化DNA。查阅gydF4y2Ba等分裂体参考表gydF4y2Ba用于切割甲基化DNA的能力不同的等裂体酶对。gydF4y2Ba
DNA unmethylatedgydF4y2Ba	有些酶需要其目标位点的甲基化。例如,gydF4y2BaDpngydF4y2BaI需要N个gydF4y2Ba6gydF4y2Ba-甲基化腺嘌呤残基的活性。看到gydF4y2Ba甲基化敏感性参考表gydF4y2Ba以进一步了解位点特异性甲基化对Promega限制性内切酶的影响。gydF4y2Ba
不活跃的酶gydF4y2Ba	在过去已被成功消化的底物DNA上测试酶，或用用于测定酶单位活性的DNA底物测试酶。通常这是Lambda DNA (Cat。# D1501)。gydF4y2Ba
次优反应条件gydF4y2Ba	参考Promega产品信息表提供的酶推荐的反应条件。建议的反应条件可以在gydF4y2Ba标准反应gydF4y2Ba本指南的一部分。gydF4y2Ba
错误的序列信息gydF4y2Ba	重复检查序列信息，确认酶识别位点的数量和位置。gydF4y2Ba
问题:gydF4y2Ba部分乳沟。gydF4y2Ba
可能的原因gydF4y2Ba	评论gydF4y2Ba
脏模板DNAgydF4y2Ba	使用Wizard®DNA清理系统(gydF4y2Ba猫。# A7280gydF4y2Ba)．或者，苯酚/氯仿萃取然后乙醇沉淀可以用来纯化DNA底物。gydF4y2Ba 基板质量和注意事项的讨论可以在gydF4y2Ba衬底的考虑gydF4y2Ba本指南的一部分。gydF4y2Ba
限制性内切酶活性丧失gydF4y2Ba	用其他几种限制性内切酶消化底物DNA，以确保消化物中的杂质不会干扰酶的活性。或者，可以使用单位活性测定条件来测试酶活性。随酶一起提供的Promega产品信息表包含该酶特定的单位活性测定条件的信息。gydF4y2Ba 有关限制性内切酶活性低的更多可能原因和解决方案，请参阅问题“酶活性低于预期”下的评论。gydF4y2Ba
酶抑制剂的存在gydF4y2Ba	底物DNA中的酶抑制剂(例如，SDS，苯酚，EDTA，氯仿，乙醇，CsCl，高盐，或微离心管中的增塑剂)可以使用Wizard®DNA清理系统(gydF4y2Ba猫。# A7280gydF4y2Ba)．或者，苯酚/氯仿萃取和/或乙醇沉淀可用于从DNA制剂中去除抑制剂。gydF4y2Ba
反应条件不当gydF4y2Ba	检查适当的反应条件，包括最佳的缓冲液，温度和酶量。建议的反应条件可以在gydF4y2Ba标准反应gydF4y2Ba本指南的部分或每种限制性内切酶提供的Promega产品信息表。gydF4y2Ba
限制性内切酶没有完全参与反应gydF4y2Ba	最后加入限制性内切酶，轻轻混合。确保酶完全混合到反应中gydF4y2Ba不要旋涡gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
使用前稀释后限制酶活性丧失gydF4y2Ba	如果可能，使用前不要稀释酶。如果酶必须稀释，使用该酶推荐的储存缓冲液。如果立即使用，酶可以在含有0.5mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的反应缓冲液中稀释。稀释到反应缓冲液中的酶不能很好地储存。gydF4y2Ba 不要直接在水中稀释酶。轻轻混合,gydF4y2Ba不要旋涡gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
限制性内切酶在加入消化物后失去活性gydF4y2Ba	酶在稀释反应时失去活性。使用添加0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的最佳限制性内切酶缓冲液来稳定反应中的酶。gydF4y2Ba
DNA浓度过高gydF4y2Ba	降低DNA浓度或使用多重反应。粘性DNA溶液可以抑制酶的消化。gydF4y2Ba
DNA浓度太低gydF4y2Ba	样本DNA浓度低于KgydF4y2Ba米gydF4y2Ba限制性内切酶。向反应中加入更多的DNA。gydF4y2Ba
退火的DNA末端(例如，lambda DNA)gydF4y2Ba	一些DNA底物的末端，比如gydF4y2Ba因为gydF4y2Balambda的末端可能在消化过程中重新退火。这会给人一种消化不完整的感觉。在凝胶电泳之前，将DNA在65°C下加热5分钟，以融化已退火的末端。限制性内切酶缓冲液的存在在加热时很重要，因为这将防止小的DNA片段融化成单链。gydF4y2Ba
限制性内切酶变性gydF4y2Ba	许多限制性内切酶可以被热灭活。同时，避免涡流稀释或含有限制性内切酶的反应。gydF4y2Ba
DNA底物是超螺旋的gydF4y2Ba	超螺旋DNA通常比线性DNA需要更多的酶单位来完成消化。限制性内切酶的单位活性用线性DNA模板测定。一个单位的限制性内切酶可以在一小时内切割一微克的线性DNA，但这可能不适用于超螺旋DNA。看到gydF4y2Ba超螺旋质粒DNA的消化gydF4y2Ba获取更多信息。或者，尝试使用每微克超螺旋DNA 5个单位的限制性内切酶在一小时内消化。gydF4y2Ba 另一种选择是用一种不抵抗超盘绕的酶线性化DNA，然后用所选的酶消化。或者，用拓扑异构酶放松DNA，然后用限制性内切酶消化。gydF4y2Ba
底物DNA每单位质量有许多酶切位点gydF4y2Ba	每种酶提供的Promega产品信息表列出了在单位活性测定中使用的底物DNA，以及底物对该酶有多少个切割位点。虽然一个单位的酶可以在一小时内切割1µg活性测定底物，但每微克切割位点更多的DNA需要更多单位的酶才能在一小时内完全消化。看到gydF4y2Ba衬底的考虑gydF4y2Ba获取更多信息。每种底物应确定酶的最佳用量。gydF4y2Ba
问题:gydF4y2Ba酶活性低于预期。gydF4y2Ba
可能的原因gydF4y2Ba	评论gydF4y2Ba
次优反应条件gydF4y2Ba	参考Promega产品信息表提供的酶推荐的反应条件。建议的反应条件也可以在gydF4y2Ba标准反应gydF4y2Ba本指南的一部分。gydF4y2Ba
酶的储存或处理不正确gydF4y2Ba	将所有限制性内切酶储存在-20°C的无霜冰箱中。使用前先将酶取出并冷藏。尽快将酶放回冷冻室。不要搅动酶或含有酶的反应混合物。相反，用温和的移液来混合。避免气泡。gydF4y2Ba
酶贮存稀释gydF4y2Ba	最好以浓缩形式储存提供的酶。如果必须稀释酶，请使用推荐的酶储存缓冲液。如果立即使用，酶可以在含有0.5mg/ml牛血清白蛋白的反应缓冲液中稀释。在反应缓冲液中稀释的酶不能很好地储存。gydF4y2Ba
酶稀释不正确gydF4y2Ba	如果酶在使用前被稀释，将酶稀释在推荐的1X反应缓冲液中，补充0.5mg/ml乙酰化牛血清白蛋白。不要直接在水中稀释酶。检查稀释系数，以确保酶浓度是正确的。酶稀释后应尽快使用。gydF4y2Ba
吸量误差gydF4y2Ba	使用正位移移液管的粘性溶液，如浓缩DNA和酶储存缓冲液，其中含有50%的甘油。gydF4y2Ba
甘油抑制gydF4y2Ba	如果添加酶的体积大于总反应体积的10%，则可能发生反应的抑制。gydF4y2Ba
反应温度次优gydF4y2Ba	检查酶提供的Promega产品信息表上的最佳反应温度。看到gydF4y2BaPromega 10X buffer中限制性内切酶的相对活性参考表gydF4y2Ba浏览Promega限制性内切酶的最佳温度清单。gydF4y2Ba
DNA底物是超螺旋的gydF4y2Ba	超螺旋DNA通常比线性DNA需要更多的酶单位来完成消化。限制性内切酶的单位活性是用线性DNA底物测定的。一个单位的限制性内切酶可以在一小时内切割一微克的线性DNA，但这可能不适用于超螺旋DNA。看到gydF4y2Ba超螺旋质粒DNA的消化gydF4y2Ba获取更多信息。或者，尝试使用每微克超螺旋DNA 5个单位的限制性内切酶在一小时内消化。gydF4y2Ba
底物DNA每单位质量有许多酶切位点gydF4y2Ba	每种酶提供的Promega产品信息表列出了在单位活性测定中使用的底物DNA，以及底物对该酶有多少个切割位点。虽然一个单位的酶可以在一小时内切割1µg活性测定底物，但每微克切割位点更多的DNA需要更多单位的酶才能在同一时间内完全消化。看到gydF4y2Ba衬底的考虑gydF4y2Ba获取更多信息。每种底物应确定酶的最佳用量。指南gydF4y2Ba高分子量DNA的消化gydF4y2Ba可以在本指南的其他地方找到。gydF4y2Ba
次优反应条件gydF4y2Ba	参考Promega产品信息表提供的酶推荐的反应条件。建议的反应条件可以在gydF4y2Ba标准反应gydF4y2Ba本指南的一部分。gydF4y2Ba
问题:gydF4y2Ba大于预期的DNA片段数量。gydF4y2Ba
可能的原因gydF4y2Ba	评论gydF4y2Ba
星活动gydF4y2Ba	其同源序列的限制性内切酶的星形活性或松弛特异性是由次优消化条件引起的。恒星活性的常见原因包括使用过量的酶(一般为>100单位/µg)，过量的甘油(>5% v/v)，锰或其他二价阳离子的存在而不是镁，或不理想的NaCl浓度。极端的pH值(特别是>pH 8.0)和DMSO、乙醇或其他有机溶剂的存在也是恒星活动的原因。有关更多信息，请参见gydF4y2Ba星活动gydF4y2Ba．gydF4y2Ba 为了避免恒星活动，使用推荐的酶消化条件，避免使用可能被盐或溶剂污染的DNA底物。建立限制性内切酶消化的条件可以在gydF4y2Ba标准反应gydF4y2Ba本指南的部分和每种酶提供的Promega产品信息表。gydF4y2Ba
样本被另一种DNA污染了gydF4y2Ba	通过检测用于单位活性测定的底物(通常为lambda DNA)或已知含有单一DNA物种的另一底物来确认限制性内切酶的活性。如果这些底物的消化模式是正确的，那么出现的额外条带可能是由于另一种DNA污染了反应。测试酶，反应缓冲液和凝胶加载缓冲液的DNA污染。gydF4y2Ba
第二限制酶的存在gydF4y2Ba	通过重复单位活性测定来检测第二活性，或用酶的确定数量的切割位点检测已知的DNA底物。gydF4y2Ba
长时间消化使反应体积减小gydF4y2Ba	在延长消化过程中，消化的体积可能会减少，特别是如果使用了嗜热限制性内切酶。反应体积的减小可能会使反应中的甘油、酶、盐或任何污染物集中，从而导致恒星活动。对于长时间消化或在高温下消化，在表面添加矿物油，减少反应的孵育时间或在培养箱中进行反应。gydF4y2Ba
错误的序列信息gydF4y2Ba	重复检查序列信息，确认酶识别位点的数量和位置。gydF4y2Ba
问题:gydF4y2Ba消化后未观察到DNA。gydF4y2Ba
可能的原因gydF4y2Ba	评论gydF4y2Ba
DNA底物浓度不正确gydF4y2Ba	在消化之前，用分光光度法或凝胶电泳法确定用于消化的DNA浓度。gydF4y2Ba 过多的RNA或盐(如胍)污染DNA样品会增加260nm处的吸光度，导致人为的高浓度测定。电泳检测DNA浓度。如有必要，分别用RNase或乙醇沉淀去除RNA或盐。gydF4y2Ba
来自细菌宿主的核酸酶污染gydF4y2Ba	如果DNA是从gydF4y2Ba结束gydF4y2BaA(+)菌株，它可能被内切酶i污染，如果是这样，当镁存在时(如在限制性内切酶消化中)，内切酶将被激活，DNA底物被消化。如有可能，请使用gydF4y2Ba结束gydF4y2BaA(-)株用于DNA底物的繁殖。向导®gydF4y2Ba+gydF4y2BaDNA纯化产品可与leyu乐鱼网gydF4y2Ba结束gydF4y2BaA(+)菌株产生无内切酶DNA。查阅gydF4y2BaWizard®Plus SV Minipreps DNA纯化系统gydF4y2Ba技术公报，#TB225获取更多信息。或者在消化前用苯酚/氯仿提取DNA样本以消除核酸内切酶I污染。gydF4y2Ba
试剂的核酸酶污染gydF4y2Ba	检测单个反应组分的核酸酶污染情况。细菌和真菌污染通常是核酸酶的来源。gydF4y2Ba
问题:gydF4y2Ba消化后观察到DNA涂片。gydF4y2Ba
可能的原因gydF4y2Ba	评论gydF4y2Ba
来自细菌宿主的核酸酶污染或试剂的核酸酶污染gydF4y2Ba	完全的非特异性消化会导致DNA底物的消失。部分消化将导致从估计DNA底物大小的一点到凝胶底部观察到DNA涂抹。gydF4y2Ba

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