Subcloning指南gydF4y2Ba

DNA琼脂糖凝胶电泳gydF4y2Ba

在琼脂糖凝胶上运行双链线性DNA(如限制性内切酶消化的质粒DNA)是分子生物学实验室的常规活动。基本方法非常简单:gydF4y2Ba

1. 按照制造商的建议设置凝胶电泳设备。gydF4y2Ba
2. 称出所需的琼脂糖量，并将其添加到适当体积的TAE或TBE 1X Buffer中，放入烧瓶或瓶子中。例如，要制备1%的琼脂糖凝胶，向100ml缓冲液中添加1.0g琼脂糖。注意:缓冲液和琼脂糖的体积不应超过容器体积的一半。gydF4y2Ba
3. 在微波炉或热板上加热混合物，以使所有琼脂糖溶解所需的最短时间。每隔一段时间停止加热，旋转容器使其混合。不要让溶液溢出来。gydF4y2Ba
   注意:容器和内容物会很热!旋转也可能导致溶液剧烈沸腾。采取适当的预防措施。gydF4y2Ba
4. 将溶液冷却至50-60°C，然后倒入凝胶。让凝胶完全形成(通常在室温下30分钟就足够了)。从凝胶中取出梳子，放入电泳室，加入足够体积的TAE或TBE 1X缓冲液，使其刚好覆盖凝胶表面。gydF4y2Ba
5. 用1X蓝/橙染料将样品装入孔中。gydF4y2Ba
6. 将凝胶设备连接到电源上，并对凝胶施加适当的电压。大于2kb的DNA片段的标准凝胶电泳通常需要5 - 8伏/厘米。较高的电压和较短的运行时间会降低凝胶的分辨率，也可能导致过热，使琼脂糖融化。gydF4y2Ba
7. 电泳完成后，取出凝胶进行染色。可以在0.5µg/ml的溴化乙锭溶液中室温浸泡30分钟，也可以在稀释至1:10 000的金刚石核酸染料溶液中，在与铸造凝胶相同类型的缓冲液中浸泡15至30分钟，并避光。leyu体育靠谱吗注意:在制备凝胶时，也可以将溴化乙锭或金刚石核酸染料掺入凝胶中，并在leyu体育靠谱吗电泳缓冲液中掺入与染色相同的浓度。这消除了电泳后染色的需要，但可能会干扰DNA片段的准确大小测定。注意:使用溴化乙锭工作时一定要戴手套。gydF4y2Ba
8. 将凝胶放置在UV灯箱上(如果使用任何一种染色剂)，或任何其他凝胶记录系统上，或如果使用金刚石核酸染料，则将凝胶放置在蓝光透光器上。leyu体育靠谱吗根据您的相机推荐的规格来拍摄凝胶。钻石核酸染料可以leyu体育靠谱吗与任何具有SYBR®金色滤镜或设置的系统进行可视化和拍照。注意:在紫外线光源下工作时，请佩戴防护眼镜。gydF4y2Ba
   注意:gydF4y2Ba如果使用溴化乙锭，在UV灯箱上观察凝胶之前，您可能希望在新鲜的1X运行缓冲液中去除或冲洗凝胶。gydF4y2Ba
   

解决方案组成gydF4y2Ba

几乎所有这些试剂都可以购买，包括琼脂糖凝胶。如果你想自己制备试剂，这里有说明。gydF4y2Ba

蓝色/橙色负载染料，6倍gydF4y2Ba(猫。# G1881)gydF4y2Ba
10mM Tris-HCl, pH 7.5gydF4y2Ba
50 mm EDTAgydF4y2Ba
15% Ficoll®400gydF4y2Ba
0.03%溴酚蓝gydF4y2Ba
0.03%二甲苯氰基醇FFgydF4y2Ba
0.4%橙色GgydF4y2Ba一个或多个染料可以从配方中省略，以创建自定义加载染料。gydF4y2Ba

TAE 50X缓冲器(1L)gydF4y2Ba(Promega [Cat.]提供10X或40X的解决方案。# V4271和V4281]):gydF4y2Ba将242g Tris碱和37.2g EDTA二水二钠溶解于900ml去离子水中。加入57.1ml冰醋酸，用水调节最终体积至1升。储存在室温或4°C。gydF4y2Ba

TBE 10X Buffer (1L)gydF4y2Ba(Promega [Cat.]提供10X解决方案。# V4251]):gydF4y2Ba将108g Tris碱和55g硼酸溶解在900ml去离子水中。加入40ml 0.5M EDTA (pH 8.0)，将最终体积增加到1L。储存在室温或4°C。gydF4y2Ba

您可能希望将您的PCR产物亚克隆到质粒克隆载体中。在PCR刚刚起步的时候，研究人员发现通过简单的钝端连接将PCR产物亚克隆到钝端质粒克隆载体中并不容易。leyu乐鱼网部分挑战是耐高温DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，以模板独立的方式将单核苷酸碱基扩展到钝性DNA的3´端(Clark, 1988。摩尔gydF4y2Ba等gydF4y2Ba, 1989)。这些聚合酶通常添加一个腺嘌呤，留下一个“A悬垂”。gydF4y2Ba

从历史上看，研究人员已经使用了几种方法来克服克隆的困难所存在的A悬垂的PCR产物。leyu乐鱼网一种方法是用Klenow片段处理产品gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDNA聚合酶I制造钝端片段进行亚克隆。然而，这种技术对PCR片段不是特别有效。gydF4y2Ba
研究人员常用的另一种方法是在PCR引物的末端添加限制性内切酶识别位点(ScharfgydF4y2Ba等gydF4y2Ba， 1986)在PCR片段中创建识别位点。然后，将PCR产物消化，并按所需的方向亚克隆到所需的质粒克隆载体中。使用这种方法时，引物设计必须小心，因为并非所有的REs都能在DNA的末端有效裂解，并且您可能无法使用您想要的每个RE (Kaufman和Evans, 1990)。一些REs需要识别位点以外的额外碱基，这增加了PCR引物的成本，也增加了引物到基因组中不相关序列的风险。gydF4y2Ba

克隆PCR产物最常用的方法是t载体克隆。leyu乐鱼网本质上，质粒克隆载体被处理为含有3´T的悬垂，以匹配扩增子的3´a悬垂(Mezei和Storts, 1989)。a尾扩增子直接连接到t尾质粒载体上，除了T4 DNA连接酶的作用外，不需要对扩增子进行进一步的酶处理。Promega公司拥有基于该技术的常规亚克隆和直接哺乳动物表达系统。gydF4y2Ba

*所有的基地都可以在3´的突出处找到;腺嘌呤是最常见的。gydF4y2Ba

T-Vector Systems: pGEM®-T和pGEM®-T Easy VectorsgydF4y2Ba

PCR亚克隆最基本的需要是一个简单、通用的克隆载体。pGEM®-T和pGEM®-T简易矢量系统正是为此目的而设计的。该载体提供了方便的T7和SP6启动子，可作为测序引物的结合位点，或在使用适当的RNA聚合酶时促进插入物任一链的体外转录。向量有gydF4y2BalacZgydF4y2Baα基因，允许使用合适的菌株(如JM109, DH5α™，XL1蓝等)进行重组的简单蓝/白筛选。pGEM®-T载体配有2X快速连接缓冲液，可在1小时内使用T4 DNA连接酶进行高效连接。你可以提供你自己喜欢的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞或购买系统与Promega JM109 Competent cells。为了获得最大的亚克隆效率，在亚克隆前对PCR产物进行纯化。引物和引物二聚体的存在会降低亚克隆效率。gydF4y2Ba

PCR克隆控制gydF4y2Ba

每个Promega PCR克隆系统都提供一个对照插入物。这个阳性对照的连接和随后的转换可以为您提供大量关于插入的连接和转换的信息。用promega提供的阳性对照插入和无插入对照获得的蓝色菌落总数应该大致相等。阴性对照也可能有一些白色菌落。gydF4y2Ba

解读t克隆实验结果gydF4y2Ba

实验插片在效率和白菌落百分比方面与对照插片相似:gydF4y2Ba成功的实验。超过80%的白色菌落应该包含插入物。gydF4y2Ba

实验插入和控制插入看起来像阴性对照:gydF4y2Ba连接失败。避免多次冻结/解冻结扎缓冲液。连接酶缓冲液含有ATP，可被冻融循环破坏。为了实验需要，您可能需要将连接酶缓冲液分成更小的比例。gydF4y2Ba

实验插入、对照插入或阴性对照均无菌落:gydF4y2Ba转型失败了。用完整的超螺旋质粒重新评估感受态细胞，并确定转化效率。使用单元格>1 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCfu /µg确保>100个菌落从对照插入结扎。gydF4y2Ba

实验插入的蓝色菌落多于对照插入或阴性对照，白色菌落少于对照插入:框内插入，α-片段未中断。gydF4y2Ba
pGEM®-T载体控制DNA将产生产生白色菌落的重组，因为lacZ阅读框被中断。白色菌落也形成成功插入其他DNA片段，破坏lacZ阅读框。偶尔，成功插入的片段不会破坏lacZ读取框，导致蓝色菌落的生长。尽管这种情况最常发生在500bp或更少的PCR产物中，但插入高达2kb的片段可能会导致蓝色菌落。leyu乐鱼网此外，一些插入dna也可能导致淡蓝色的菌落或“靶心”菌落，中心是蓝色的，周围是白色的。这些仍然是成功的插入。gydF4y2Ba

利用含有限制位点的PCR引物进行亚克隆gydF4y2Ba

有可能是所需插入DNA的末端不包含合适的限制性内切酶位点。这个问题可以通过PCR在合适的位置生成一个位点来解决。对于该技术，限制性内切酶位点被设计到PCR引物的5´端。由于某些限制性内切酶不能有效地切割位于DNA片段末端的识别序列，因此建议在限制性内切识别位点前面包含至少四个额外的碱基。对于大多数限制性内切酶，这将导致有效的裂解。gydF4y2Ba

消化PCR产物的成功与否取决于PCR产物的纯度。leyu乐鱼网与实际PCR产物相比，引物和引物二聚体以压倒性的数量存在。你的PCR产物将与引物和引物二聚体竞争限制性内切酶的注意力，导致有利于部分限制性内切酶消化的条件。在进行PCR后，用Wizard®SV凝胶和PCR清理系统对反应进行简单的清理，可以提高限制性内切酶的裂解。gydF4y2Ba

如果遇到聚合酶链反应产物不能亚克隆的情况，摘要可能会因靠近聚合酶链反应产物末端而受到不利影响。PCR产物可以亚克隆到pGEM®-T Easy Vector中，该载体具有适当放置的酶切位点以提高效率。gydF4y2Ba

的属性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaSubcloning菌株gydF4y2Ba

常见的实验室菌株gydF4y2Ba大肠杆菌,gydF4y2Ba如JM109、DH5α™和XL-1 Blue，与野生型不同。这些菌株携带一些旨在帮助繁殖质粒的突变。通常，实验室菌株在gydF4y2BarecAgydF4y2Ba基因(gydF4y2BarecA1gydF4y2Ba)，是一种参与重组的基因。该突变基因限制了质粒与细胞的重组gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba基因组，使质粒插入更稳定(gydF4y2BarecA1gydF4y2Ba变异比gydF4y2BarecA13gydF4y2Ba突变)。每一个菌株都携带gydF4y2BaendA1gydF4y2Ba在纯化过程中可能与质粒共纯化的核酸酶失活的突变。这种突变可以纯化出更高质量的质粒。必须对来自不具有这种突变的菌株的质粒进行特殊处理(例如，RR1, HB101等)，以消除质粒准备中的核酸酶(例如，碱性蛋白酶消化)。gydF4y2Ba

常见的实验室菌株gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba根据EcoKI或EcoBI周围的酶切系统和修饰系统的存在，通常将其定义为K株或B株。在野生型K菌株中gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba将有EcoKI限制性内切酶切割外源DNA和EcoKI甲基化酶保护和掩盖宿主DNA识别序列。在B株中，EcoBI限制性内切酶和甲基化酶起同样的作用。JM109、DH5α™和XL-1 Blue等菌株为K株，但携带hsdR17 (rK -， mK+)突变。这种突变敲除了EcoKI限制性内切酶，但甲基化酶完好无损。因此，这些菌株不会降解从B或K菌株分离出来的质粒DNA，但会将其甲基化。如果DNA必须转移到具有完整K限制和甲基化系统的K菌株，这是有用的。gydF4y2Ba

如果希望将蓝色/白色选择合并到子克隆方案中，则需要进行转换gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba拿着一个gydF4y2BalacZ∆gydF4y2Ba．这种突变删除了β-半乳糖苷酶基因的一部分，留下了所谓的ω片段。质粒载体提供被删除的部分，或α片段。质粒一旦进入细菌，就会产生α-片段和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba产生ω-片段，结合形成功能β-半乳糖苷酶。如果在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β- d -半乳糖苷(X-gal)的培养皿上生长，菌落会因β-半乳糖苷酶活性而变成蓝色，表明质粒与细菌完全互补。这被称为α互补。蓝/白克隆方法使用在α片段编码序列中具有多个克隆区域的质粒。由于插入物的存在而导致阅读框的破坏将产生无法进行α-互补的无功能α-片段。这些被破坏的质粒与没有插入的质粒通过菌落的颜色(白色与蓝色)进行区分，因此称为蓝/白选择。JM109、DH5α™和XL-1 Blue等菌株有必要的缺失。这些菌株之间的一个区别在于如何让细菌产生ω-片段。JM109和XL-1 Blue都有第二种叫做lacIq的突变。这种突变导致LacI抑制因子的增加，从而阻止转录gydF4y2Ba虫胶gydF4y2Ba操纵子直到衬底出现。为了缓解这种抑制，这些菌株在含有不可裂解乳糖类似物，异丙基-β- d -硫半乳糖吡甘甙(IPTG)的培养基上生长。DH5α™没有lacIq突变，通过lac操纵子的泄漏转录不断产生低水平的ω-片段，因此不需要IPTG进行蓝/白选择。gydF4y2Ba

制造你自己的能力细胞gydF4y2Ba

感受态细胞的制备:改良RbCl法gydF4y2Ba

这种氯化铷方案比氯化钙具有更好的转化效率gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba程序，对大多数菌株。该程序是Hanahan, D.(1985)中描述的一种改编，在:DNA克隆，第1卷，D. Glover主编，IRL出版社，伦敦，109。gydF4y2Ba

用户提供的材料gydF4y2Ba

• LB介质和板gydF4y2Ba
• LB + 20mM MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba
• TFB1,冰冷的gydF4y2Ba
• TFB2,冰冷的gydF4y2Ba
• 干冰/异丙醇浴或液氮gydF4y2Ba

1. 从LB板上取一菌落接种2.5ml LB培养基于电镀管中。对于JM109，使用M9 + B1板，以保持F´片段。将试管在37°C下摇晃(大约225转/分钟)孵育一夜。gydF4y2Ba
2. 以1:100稀释过夜培养。将添加20mM MgSO4的250ml LB接种于1L烧瓶中，并加入2.5ml过夜培养液。在37°C摇晃培养细胞，直到OD600达到0.4-0.6(通常为5-6小时，但时间可能不同)。gydF4y2Ba
3. 在4°C下以4,500 × g离心5分钟将细胞制成颗粒。对于250ml的培养，使用两个250ml的离心瓶在一个大转子;一半在一个瓶子里，一半在另一个瓶子里。一定要使瓶子保持平衡。gydF4y2Ba
4. 将细胞颗粒放入原来体积0.4倍的冷冻TFB1中轻轻重悬。对于250ml传代培养，总共使用100ml TFB1 (50ml/瓶离心)。将重悬的细胞组合在一个瓶子里。在剩下的步骤中，将细胞放在冰上并冷却所有的移液管、试管和烧瓶。gydF4y2Ba
5. 将重悬的细胞置于冰中4°C孵育5分钟。gydF4y2Ba
6. 在4°C下以4,500 × g离心5分钟将细胞制成颗粒。gydF4y2Ba
7. 轻轻地将细胞重新悬挂在原来体积的1/25冰冷的TFB2中。对于250ml的传代培养，使用10ml的TFB2。gydF4y2Ba
8. 将细胞在冰上孵育15-60分钟，然后在-70°C下分配100µl/管储存。在配药过程中，尽量保持细胞的低温。在干冰/异丙醇浴或液氮中快速冷冻试管，并在-70°C保存。用该方法制备的JM109感受态细胞在不解冻的情况下可稳定1年。gydF4y2Ba

注意:gydF4y2Ba可以使用冰浴架或ChillBlock™方便地快速冷冻活性细胞。准备一个冰浴和一个乙醇浴。把管子贴在盖子上。打开贴有标签的试管，把它们放在冰浴的架子上。每管加入100 μ l细胞，然后关闭管。在乙醇浴中加入干冰，等待其停止冒泡，然后将机架和管道转移到干冰浴中约15秒。如果没有干冰，可以在乙醇浴中使用普通冰，但不会发生闪冻。将试管转移到它们的存储盒中，并放置在-70°C的冰箱中。不要让酒精沾到管口。液氮也可以用于快速冷冻，但要确保它与你正在使用的架子兼容。 Use only plasticware designed for liquid nitrogen.

注意:gydF4y2Ba注意不要把酒精弄到标签上，因为它会把标签弄掉。gydF4y2Ba

许多gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba菌株携带片段(例如，F´和P2)，扩大了细菌在亚克隆应用中的能力。例如，XL1-Blue和JM109菌株在F´片段上携带lacIq∆M15突变。发作是染色体外复制质粒与一个可选择的标记。当从具有发作的菌株中制备活性细胞时，必须首先将细菌镀在选择性培养基上。对于XL1-Blue，菌落选择在四环素板上，因为外显体包含tetR基因。这意味着该菌株不能与含有tetR基因的亚克隆质粒用于选择。JM109细胞应首先在含有硫胺素(维生素B1)的M9微量培养基上选择。细菌染色体缺乏脯氨酸合成的生物合成基因(proAB)，但附属体携带这些基因。在M9 + B1培养皿上培养的菌落(配方见第48页)可以被加工成胜任细胞，用于蓝/白选择。gydF4y2Ba

感受态细胞转化效率的测定gydF4y2Ba

这是与上面提供的产生胜任细胞的程序一起使用的一般方案。使用购买的合格电池时，请遵循制造商的说明。请记住，从连接反应中转化超过10ng的DNA实际上可能会降低转化效率。gydF4y2Ba

1. 将100 μ l的合格细胞放在冰上解冻。gydF4y2Ba
2. 将100 μ l的细胞转移到17 × 100mm的聚丙烯管中，并在冰上冷冻。gydF4y2Ba
3. 将0.1ng的超卷质粒[例如，pGEM®-3Zf(+) Vector]以10µl的体积加入到活性细胞中，并通过旋转移液器尖端轻轻混合(不要通过移液混合)。gydF4y2Ba
4. 将试管从冰中转移到42°C的水浴中，热休克45-60秒。立即放在冰上冷却至少2分钟。gydF4y2Ba
5. 加入890 μ l的SOC培养基(浓度为0.1ng DNA/ml)，在37°C下摇晃(~150rpm)孵育45分钟。gydF4y2Ba
6. 将100µl细胞转移到900µl SOC培养基中稀释细胞(给予0.01ng DNA/ml的浓度)。将100µl稀释后的细胞置于LB板上，并加入适当的抗生素。您可能希望板100 μ l未稀释的细胞，以确定效率以及。gydF4y2Ba
7. 在37°C的培养箱中孵育过夜，并计数获得的菌落数量。gydF4y2Ba

转化连接反应gydF4y2Ba

这是与上面提供的产生胜任细胞的程序一起使用的一般方案。使用购买的合格电池时，请遵循制造商的说明。gydF4y2Ba

1. 将100 μ l的合格细胞放在冰上解冻。gydF4y2Ba
2. 将各100 μ l的合格细胞转移到预冷冻的17 × 100mm聚丙烯管中。gydF4y2Ba
3. 从连接反应中加入不超过10ng的DNA，最多10µl，轻轻旋转移液器尖端混合(不要通过移液混合)。在冰上孵育30分钟。gydF4y2Ba
4. 将试管从冰中转移到42°C的水浴中，热休克45-60秒。立即放在冰上冷却2分钟。gydF4y2Ba
5. 加入1ml LB或SOC培养基，在37°C下摇晃(~150rpm)孵育45分钟。gydF4y2Ba
6. 将100-200 μ l的转化混合物或适当的稀释剂涂在选择板上。如果您怀疑连接效率低，将剩余的细胞和颗粒在微型离心机中快速旋转10-20秒。倒出介质，在约200 μ l的SOC和平板中重悬颗粒。gydF4y2Ba

200cfu = 2 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCfu /ng = 2 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2Bacfu /µg DNAgydF4y2Ba

转换控制gydF4y2Ba

控件可以帮助您确定在子克隆过程中哪里出现了问题。当用你的亚克隆反应DNA转化细菌时，也要确定转化效率。转换切断、无插入的去磷酸化载体的连接控制，可以告诉您在实际的载体+插入连接中可以期望有多少背景菌落。gydF4y2Ba

现在你已经转化了你的DNA，让菌落在一夜之间生长，你需要确定它们是否含有感兴趣的插入物。你可以用菌落聚合酶链反应来筛选它们，也可以用更传统的质粒微型prep，然后再用限制性内切酶切。菌落PCR是最快速的初始筛选方法。质粒微型准备将需要额外的一天来培养，但将为进一步分析提供大量材料。一些研究人员选择两者都做，但只对通过菌落PCR鉴定的菌落进行微型准备，以包含感兴趣的插入物。gydF4y2Ba

菌落PCRgydF4y2Ba

菌落聚合酶链反应包括裂解细菌和扩增一部分质粒。如果你的子克隆方案不会保持插入物的方向，你甚至可以使用集落PCR来筛选方向。你可以使用插入特异性引物或载体特异性引物来筛选重组质粒。简单地结合一个矢量特异性引物和一个插入特异性引物。gydF4y2Ba

使用Taq DNA聚合酶留下的a -悬垂物和适当的t尾载体(例如，pGEM®-T Easy vector)进行PCR克隆不是一种保留方向的技术。利用载体特异性引物和插入特异性引物，可以快速地进行菌落PCR定位。例如，该技术用于筛选1.8kb插入到pGEM-T Easy Vector中的方向。用T7启动子引物和插入特异性的正向或反向PCR引物进行集落PCR。从克隆实验中选取8个白色菌落进行分析。具有T7取向的克隆只会产生带有T7引物和反向PCR引物的片段，而相反(SP6)取向的克隆只会产生带有正向PCR引物的片段，如下图所示。gydF4y2Ba

菌落PCR的菌落准备gydF4y2Ba

1. 选择一个分离良好的菌落，转移到50 μ l无菌水中。如果需要，可以将部分菌落转移到含有适当抗生素的LB培养基中进行过夜培养和小型准备。gydF4y2Ba
2. 在无菌水中将菌落煮沸10分钟。gydF4y2Ba
3. 离心16000倍gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。gydF4y2Ba
4. 在50µl PCR中使用5µl上清液。gydF4y2Ba

质粒Miniprep和酶切酶切筛选gydF4y2Ba

筛选菌落的经典方法包括进行质粒迷你准备，然后进行限制性内切消化。分离良好的菌落从培养皿中取出，转移到含有适当抗生素的培养基中进行选择。正确的无菌技术很重要。许多不同的培养基配方通常用于微型制剂。Promega推荐添加抗生素的LB培养基进行小型准备培养。如果使用非常丰富的培养基，如Terrific Broth，细菌可以生长到非常高的细胞密度，耗尽抗生素。一旦抗生素耗尽，保留质粒的选择压力就会被移除，质粒可能就会丢失。gydF4y2Ba

你可以将菌落接种到1-10ml的培养基中。如果使用高复制质粒，1-5ml(更典型的是1-2ml)就足够了。如果你使用的是低复制质粒，接种10ml。曝气培养对最大细胞密度是非常重要的。一个17 × 100mm的培养管可以培养1-2ml。如果生长的体积较大，50ml无菌一次性培养管是更好的选择。摇晃(~250rpm)培养过夜(12-16小时)。记住，表面积越大，曝气越大。你甚至可以在无菌的25-50ml Erlenmeyer烧瓶中培养微型培养物。gydF4y2Ba

一旦DNA被纯化，部分质粒通过限制性消化进行筛选。对于高拷贝质粒，每次纯化可获得4-10µg质粒DNA (1-5ml)。对于低复制质粒，每次纯化(10ml)可获得1-3µg质粒DNA。在消化液中使用0.5-1µg质粒。设计摘要，这样你可以很容易地确定你的质粒是否含有插入物。gydF4y2Ba
注意:gydF4y2Ba确保在同一凝胶上运行未切割的质粒进行比较。gydF4y2Ba

1. Clark, J.M.(1988)由原核和真核DNA聚合酶催化的新型非模板核苷酸加成反应。gydF4y2Ba诊断。酸Res。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba, 9677 - 86。gydF4y2Ba
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