质谱用蛋白酶消化

胰蛋白酶活性的严格特异性是蛋白质鉴定的关键。然而，自溶可降低特异性，产生特异性扩大的假胰蛋白酶和凝乳胰蛋白酶样活性(Keil-Dlouhaet al .,1971)。自溶可能导致额外的肽片段，可能会干扰数据库分析和蛋白质鉴定。

赖氨酸残基的还原性甲基化抑制自溶，产生高度稳定的分子(Riceet al .,1977)。为了获得最大的特异性，Promega提供测序级修饰胰蛋白酶(Cat。# V5111和V5117)，经过还原甲基化和TPCK处理，以提高胰蛋白酶裂解的特异性。TPCK能抑制糜蛋白酶的活性。为了进一步提高蛋白水解效率，Promega开发了一种更活跃的胰蛋白酶金，质谱级(Cat。# V5280)。更多信息和详细的方案可在Trypsin Gold质谱级技术公报#TB309中获得。

为胶液蛋白质消化

凝胶内蛋白质消化的方法有很多(Flanneryet al .,1989;舍普琴科et al .,1996;罗森菲尔德et al .,1992)。下面的程序已经被Promega的科学家成功地使用了。有关更精简的协议，请参阅使用胰蛋白酶和蛋白酶emax™表面活性剂的凝胶内消化蛋白质的协议，蛋白酶emax™表面活性剂中的胰蛋白酶增强剂，胰蛋白酶增强剂，技术公报#TB373。

所需的材料：

• 质谱级(Cat;# V5280)和协议
• SimplyBlue™SafeStain (Invitrogen Cat.)# LC6060)
• 三氟乙酸(组织)
• 乙腈(ACN)
• 200毫米NH₄HCO_3.缓冲(pH值7.8)
• 50毫米醋酸
• NANOpure®水
• ZipTip®scx移液针尖(Millipore Cat。# ZTSCXS096)或ZipTip®C18移液头(Millipore Cat。# ZTC18S096)
• 0.5ml微离心管用50% ACN/0.1% TFA预洗两次
• 速度休假®集中器

1. 用sds - tris -甘氨酸凝胶电泳分离蛋白质样品。
   注意:其他凝胶系统和染色试剂可用于凝胶内消化，但应进行测试，以确保与所使用的蛋白质和检测系统的相容性。
2. 用NANOpure®水冲洗凝胶5分钟。重复两次，总共洗三次。在SimplyBlue™SafeStain中室温温和搅拌染色1小时。染色完成后，丢弃染色液。
3. 将凝胶在室温下的nanoure®水中浸泡1小时，轻轻搅动。脱除完成后，丢弃溶液。
4. 使用干净的刀片，从凝胶中切下感兴趣的蛋白带，尽可能多地去除聚丙烯酰胺。将凝胶片放入0.5ml用50% ACN/0.1% TFA预洗两次的微离心管中。
5. 用0.2ml 100mM NH去除凝胶片₄HCO3/50% ACN在37°C下加热45分钟。重复此步骤一次。
6. 凝胶片在100μl 100% ACN中室温脱水5分钟。脱水后，凝胶片会比原来的尺寸小很多，外观呈白色或不透明。
7. 在Speed Vac®浓缩器中室温干燥凝胶片10-15分钟。
8. 胰酶金以1μg/μl重悬于50mM醋酸中，然后用40mM NH稀释₄HCO_3./10% ACN至20μg/ml。将凝胶片放入最小体积(10-20μl)胰蛋白酶溶液中，室温(不超过30℃)预孵育1小时。切片在这段时间内会重新补水。若1小时后凝胶片呈白色或不透明，可在室温下再加10-20μl胰蛋白酶孵育1小时。
9. 加入足够的消化缓冲液(40mM NH)₄HCO_3./10% ACN)完全覆盖凝胶片。把管子盖紧以避免蒸发。在37°C下孵育一夜。
   
10. 用150μl的NANOpure®水孵育凝胶片10分钟，并频繁涡旋混合。将液体取出并保存在新的微离心管中。
11. 用50μl 50% ACN/5% TFA(混合)在室温下提取凝胶片两次，每次60分钟。
12. 将所有提取液(从步骤10和11)放入池中，在Speed Vac®浓缩器中室温干燥2-4小时(不要超过30°C)。
13. 按照制造商的说明，使用ZipTip®移液针尖(Millipore公司)纯化和浓缩提取的肽。
14. 从ZipTip®针尖中洗脱的肽可以用于质谱分析。

在溶液中蛋白质的消化

通常情况下，蛋白质被还原，然后烷基化，使胰蛋白酶立即进入内部裂解位点。这保证了质谱分析中蛋白质序列的高覆盖率(Wilkinson, 1986)。如果不需要高序列覆盖率，则可以省略还原和烷基化步骤。注意:要消化非还原蛋白，请从步骤3开始。

1. 将目标蛋白溶于8M尿素/50mM Tris-HCl (pH 8)[或50mM碳酸氢铵(pH 7.8)]/ 5mM DTT中，37°C孵育1小时。
   注意:不建议使用氯化胍(GuCl)使蛋白质变性，因为即使低浓度的GuCl也会抑制胰蛋白酶。
2. 加入碘乙酰胺至终浓度15mM，室温避光孵育30分钟。
3. 用三体积的50mM Tris-HCl (pH 8)[或50mM碳酸氢铵(pH 7.8)]稀释反应，将尿素浓度降低到2M。为了消化原生蛋白质，将蛋白质溶解在50mM nhh中₄HCO_3.(pH 7.8)或50mM Tris-HCl (pH 8)不含尿素。
4. 添加胰酶金，质谱级，到最终蛋白酶:蛋白质比1:100到1:20 (w/w)。在37°C下孵育一夜。
5. 添加终浓度为1%的TFA或甲酸终止消化，用高效液相色谱(HPLC)或液相色谱-质谱(LC/MS)分析样品。

胰蛋白酶在自下而上蛋白质组学中的使用可能会对掌握完整蛋白质组的能力施加一定的限制。紧密折叠的蛋白质可以抵抗胰蛋白酶的消化。翻译后修饰(PTMs)对胰蛋白酶提出了不同的挑战，因为聚糖通常限制胰蛋白酶进入裂解位点，而乙酰化使赖氨酸和精氨酸残基对胰蛋白酶消化产生抵抗。

为了克服这些问题，蛋白质组学界已经开始探索替代蛋白酶来补充胰蛋白酶。然而，当使用这些替代蛋白酶时产生的协议以及预期结果还没有系统的记录。

Giansanti等人(2016)已经创建了6种备选蛋白酶的优化协议，这些蛋白酶在蛋白质组学中已经显示出了应用前景，即糜蛋白酶、Lys-C、Lys-N、Asp-N、Glu-C和Arg-C。

在某些情况下胰蛋白酶不能提供足够的蛋白质水解。例如，许多膜蛋白的胰蛋白酶裂解位点数量有限。在其他情况下，胰蛋白酶裂解位点的分布是次优的，导致肽段过长或过短，无法进行质谱分析。Promega提供各种替代蛋白酶，补充胰蛋白酶，并允许高效的蛋白质分析与质谱。图5突出显示了蛋白质质谱分析的替代蛋白酶糜凝蛋白酶的好处。

特有的蛋白酶

argc,测序年级(猫。#V1881)，也被称为clostripain，是一种内肽酶，在精氨酸残基c端裂解，包括脯氨酸旁边的位点。Arg-C活性在pH 7.6-7.9时最佳。

Asp-N,测序年级(猫。#V1621)，是一种内源性蛋白酶，可水解天冬氨酸残基n端肽键。pH值为4.0 ~ 9.0时，Asp-N活性最佳。

raspn，质谱仪级(猫。#VA1160)，是从嗜麦芽窄食单胞菌中克隆并纯化的重组蛋白酶大肠杆菌．

胰凝乳蛋白酶,测序年级(猫。#V1061)，是一种来自牛胰腺的丝氨酸内蛋白酶。蛋白酶优先水解芳香氨基酸的羧基侧:酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。凝乳胰蛋白酶活性在pH 7.0-9.0时最佳。

Glu-C,测序年级(猫。#V1651)，是一种丝氨酸蛋白酶，在碳酸氢铵或醋酸铵存在时，专门裂解谷氨酸残基的c端。在磷酸盐缓冲液中，裂解也发生在天冬氨酸残基上。葡萄糖- c活性在pH 4.0-9.0时最佳。

rlysc，质谱级(猫。#V1671)，为表达的重组内源性蛋白酶lysc大肠杆菌．rlysc的序列来源是绿脓杆菌中的蛋白酶IV。与天然的赖氨酸- c相似，赖氨酸- c在赖氨酸残基的c端具有特殊的特异性，并在变性条件下保持蛋白水解活性。rlyss - c活性在pH 8.0-9.0时最佳。

质谱级内源性蛋白酶lysc(猫。#VA1170)，是一种高度纯化的丝氨酸蛋白酶，专门水解赖氨酸的羧基侧。lysc在强蛋白质变性条件下仍保持蛋白水解活性．

非特异性蛋白酶

弹性蛋白酶(猫。#V1891)是一种丝氨酸蛋白酶，优先裂解丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸残基的c端。弹性蛋白酶活性在pH值为9.0时最佳。

胃蛋白酶(猫。#V1959)优先裂解在苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和色氨酸残基的c端。胃蛋白酶活性在pH值1.0-3.0时最佳。

嗜热菌蛋白酶(猫。#V4001)是一种耐热金属蛋白酶。热溶素优先在疏水残基的n端裂解亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸。最佳消化温度范围为65-85℃。热溶素活性在pH 5.0-8.5时最佳。

ProteaseMAX™表面活性剂，胰蛋白酶增强剂，能够快速有效地利用蛋白酶(如胰蛋白酶和lysc)在溶液和凝胶中消化蛋白质。表面活性剂是一种高效的蛋白质增溶剂。(图6)。作为尿素的添加剂，ProteaseMAX™表面活性剂提高了尿素的增溶效果。

ProteaseMAX™表面活性剂为凝胶内蛋白质消化提供了几个优势。首先，这种表面活性剂通过增强蛋白质消化和肽提取来改善蛋白质识别(图7)。其次，表面活性剂最大限度地减少塑料制品对肽的吸附，这是凝胶内蛋白质消化过程中肽损失的主要原因。第三，ProteaseMAX™表面活性剂消除了消化后提取的需要，并加速消化。在有ProteaseMAX™表面活性剂存在的情况下，凝胶内蛋白质消化仅需1小时即可完成。

ProteaseMAX™表面活性剂是一种阴离子表面活性剂，在消化反应过程中降解，生成对质谱无害的降解产物。leyu乐鱼网这一特性消除了消化后降解的需要。

使用胰蛋白酶和蛋白酶emax™表面活性剂，胰蛋白酶增强剂在凝胶中消化蛋白质

凝胶内蛋白质消化省时省力。消化步骤在1小时内完成，而ProteaseMAX™表面活性剂可同时从凝胶中提取多肽，消除了消化后多肽提取的需要。表面活性剂还提高了长肽的回收率，通常使用标准提取方案保留在凝胶中。有关详细的协议，请参阅ProteaseMAX™表面活性剂，胰蛋白酶增强剂，技术公报#TB373。