蛋白质表达导论
订购关于这里讨论的产品的信息，请访问我们的蛋白表达产品页面。leyu乐鱼网
翻译生物学概论
细胞游离蛋白合成(CFPS)，也被称为体外转录/翻译，是分子生物学家在基础和应用科学中阐明细胞途径和机制的工具集合中重要和通用的主要内容。它已成为高通量功能基因组学和蛋白质组学中日益流行和有用的方法，比在活细胞中进行的蛋白质表达具有显著优势。
细胞游离蛋白表达的起源
无细胞表达的基本原理早在19世纪末就已经出现了，当时研究人员Eduard Buchner首次提出了这一概念，他将这一概念发展为一种在酵母提取物中将糖转化为二氧化碳和乙醇的方法。
在随后的几年里，为了回答这个古老的问题，实验室开始采用蛋白质合成技术:氨基酸在蛋白质中到底扮演什么角色?科学家马歇尔·尼伦伯格和海因里希·马泰伊在1961年对这个基本问题的答案上取得了巨大突破，他们成功地应用了细胞外蛋白表达来连接核苷酸三联及其编码的氨基酸。
采用一种基于的体外翻译系统大肠杆菌，他们能够合成多肽多苯丙氨酸。从那里，他们能够确定氨基酸苯丙氨酸和它对应的密码子UUU之间的联系，基本上发现了破解遗传密码的关键。这个开创性的实验最终将导致破译所有剩下的氨基酸密码子，并为今天可用的各种各样的翻译生物学系统奠定了基础(2)。
翻译生物学基本原理“，
今天现有的系统组合，虽然延伸到广泛和多样化的光谱，都属于两种类型的无细胞表达系统:翻译系统和偶联转录和翻译(TnT®)系统。尽管系统之间存在差异，但无细胞反应的基本原理是相同的。
无细胞表达始于从培养的细胞中产生的粗提取物，这些细胞通常参与了高速率的蛋白质合成，如未成熟的红细胞(网状细胞)。这些粗提取物的内源性DNA和mRNA被耗尽，细胞裂解液随后被添加进行翻译所需的大分子成分，包括核糖体、trna、氨基酰基trna合成酶和起始、延伸和终止因子。然后，通过添加合适的模板(DNA或mRNA)开始翻译过程，并在合适的温度下进行。在翻译系统中，反应由纯化的mRNA启动，而由线性或质粒DNA模板启动的系统被称为耦合转录和翻译(TnT®)系统。
为了确保有效的转化，每一种提取物都需要额外补充氨基酸、能量来源(ATP、GTP)、能量再生系统和盐(如镁)2 +K+)．在真核生物系统中，磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶通常作为能量再生系统，而原核生物系统通常由磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶补充。此外，偶联转录和翻译系统通常也提供了噬菌体衍生的RNA聚合酶(T3, T7或SP6)，它从外源DNA模板转录mRNA，并允许在T3, T7或SP6启动子下游克隆的基因表达。
细胞提取和系统选择
在为您选择合适的无细胞蛋白表达系统时，有几个因素需要考虑，包括您将使用的模板类型，您期望的蛋白产量和预期的下游应用。
到目前为止，市面上最流行的体外翻译系统包括大肠杆菌、小麦胚芽、兔网织细胞或昆虫细胞提取物。由于这些细胞的行为和功能各不相同，它们的衍生提取物也是如此，每一种细胞都有各自的优点和缺点，简要强调如下(1;3)。
原核的大肠杆菌系统是目前最流行的蛋白表达系统，有几个原因。大肠杆菌提取制备方法简单、廉价，如大肠杆菌使用低成本的培养基容易大量发酵，使用高压均质器容易破裂。大肠杆菌基于的系统通常也能获得最高的蛋白质产量，和总反应成本大肠杆菌制度是集体最低的。大肠杆菌能够激活提取物中的代谢反应，进而为高水平的蛋白质合成提供燃料，这就不需要更昂贵的能量基质，如磷酸烯醇丙酮酸。
小麦胚芽提取液(WGE)、兔网状细胞裂解液(RRL)和昆虫细胞提取液(ICE)是目前应用最广泛的真核生物系统。这些系统有利于生产更复杂的蛋白质，也可以实现翻译后修饰没有发现大肠杆菌．然而，这些真核系统通常涉及更费力的提取制备过程，这可能会增加成本。在批量反应中，真核系统也容易导致较低的蛋白质产量大肠杆菌系统。
小麦胚芽和兔网织红细胞裂解液的无细胞提取物支持多种病毒、原核和真核mrna的体外转译。这些rna驱动系统被广泛用于识别mRNA种类和表征其产物。leyu乐鱼网从感兴趣的DNA开始，体外转录本(5- - - - - -80µg/ml)可通过RiboMAX™大规模RNA生产系统(猫。# P1280，P1300)和T7 RiboMAX™快速大规模RNA生产系统(猫。# P1320)．
大肠杆菌S30提取物(ECE):
优势:萃取制备方法简单，成本效益高。ECE系统具有折叠复杂蛋白质的能力，始终具有较高的蛋白质合成率和由此产生的高蛋白质合成收率。此外，能源是低成本的，目前的方法是很好的理解，有许多完善的工具可以进行基因改造。
缺点:可选的翻译后修饰数量有限，没有内源膜结构用于合成完整的膜蛋白。
小麦胚芽提取物(WGE):
优点:利用WGE已经多次实现了真核蛋白的广谱表达。这也是一个高产的系统，转化为高产量的复杂蛋白质。复杂的高通量蛋白质组学方法。
缺点:裂解液的制备可能是昂贵和劳动密集型的。有限的翻译后修饰是可能的，整体膜蛋白的合成没有内源性膜结构与原核系统相比，WGE提供了较低的蛋白质产量。
兔网状细胞裂解物(RRL):
优点:细胞易破碎，提取制备过程快．RRL制度是一个久经考验的、完善的制度。该系统非常适合于哺乳动物系统的真核特异性修饰，蛋白质产量中/低。
缺点:蛋白质产量低。翻译后修饰只能通过补充外源性微粒体膜来实现。
昆虫细胞提取液:
优势：细胞易破碎，提取制备过程快。许多真核特异性翻译后修饰都可以使用该提取物，包括糖基化、二硫桥形成、脂化和信号肽裂解磷酸化。内源性微粒体也可用，直接合成和整合膜蛋白已成功地使用这种提取物。
缺点:昆虫细胞提取物的培育成本较高。
准备好开始寻找你的系统了吗?探索我们的广度蛋白表达的投资组合为您的无细胞蛋白表达需求找到正确的解决方案。
无细胞蛋白表达系统的优势
与基于细胞的蛋白质表达相比，无细胞的蛋白质表达系统具有几个明显的优势，包括提高了全长蛋白质的总体产量，这些蛋白质既具有功能性又具有可溶性，而且节省了大量时间。典型的体内方法最多需要几天，最多需要几周才能完成(4)。与此形成鲜明对比的是，体外翻译反应，包括花在制备提取物上的时间，可以在短短几个小时内完成，这提供了将表型(表达蛋白的功能)与基因型相关联的最快方法。
利用无细胞的方法，蛋白质合成也是多才多艺的，因为它可以使用各种输入进行。无细胞翻译系统利用mRNA作为模板，而质粒DNA或线性PCR片段都可以作为DNA模板在转录/翻译耦合系统。
CFPS的另一个优点是它是一个开放的反应。由于无细胞蛋白的表达不受细胞壁的限制，直接操纵化学环境的可能性很大，允许添加外部成分和分子来创造更有利于蛋白质折叠和活性的条件(5)。CFPS格式允许主动监测、快速采样和筛选，而不需要基因克隆步骤(3)。
由于没有细胞障碍来限制翻译控制，CFPS系统也是合成传统上难以表达和随后分析的蛋白质的理想方法。膜蛋白、病毒蛋白、毒性蛋白以及通过细胞内过程进行快速蛋白水解降解的蛋白，在没有细胞内部代谢或生化途径需要对抗的情况下，也更容易表达。因此，减轻了对产品蛋白质潜在毒性的担忧。
从核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)到使用显示技术的酶工程，各种各样的无细胞蛋白表达系统有助于广泛的蛋白质表征应用。leyu体育靠谱吗无细胞的方法还可以通过修饰的带电trna或氨基酸，用荧光、生物素、放射性或重原子对特定蛋白质进行标记。
细胞无转录和/或翻译系统提供了相当大的效用，特别是在功能蛋白质组学中。特别是，高产量表达系统的最近发展扩大了它们的应用范围(6)。
通过翻译系统
兔网织细胞裂解物翻译系统(核酸酶处理和未处理)和小麦胚芽提取系统用于mRNA的翻译。兔网织细胞裂解物，核酸酶处理(猫。# L4960)，通过添加一些补充物来优化mRNA的翻译。其中包括抑制血红素调节的eIF-2a激酶(HRI)激活的血红素;由预先测试的磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸组成的能量产生系统;和小牛肝脏的tRNA，以平衡接受tRNA的数量，从而优化密码子的使用，扩大可有效翻译的mrna的范围。此外，两种裂解物都用微球菌核酸酶处理以消除内源性mRNA，从而减少背景翻译。的福莱希®兔网状细胞裂解物体系(猫。# L4540)提供了比兔网织细胞裂解液，核酸酶处理的反应条件更大的灵活性，允许翻译反应的参数范围更广，包括Mg2 +和K+浓度，并提供添加DTT的选择。
与处理过的RRL相比，未处理的兔网状细胞裂解液(猫。# L4151)，含有蛋白质合成所必需的细胞成分(tRNA、核糖体、氨基酸、起始、延伸和终止因子)，但尚未用微球菌核酸酶处理。未处理的兔网织细胞裂解液不推荐用于特异性mrna的体外翻译。
小麦胚芽提取液(猫。# L4380)包含蛋白质合成所需的细胞成分(tRNA，核糖体，起始，延伸和终止因子)。该提取物通过添加由磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶组成的能量产生系统进一步优化，亚精胺刺激链伸长的效率，从而克服过早终止，乙酸镁的浓度推荐用于大多数mRNA种类的翻译。只有添加外源氨基酸(包括适当标记的氨基酸)和mRNA才能刺激翻译。为了进一步优化，可以添加醋酸钾来翻译广泛的mrna。
无细胞转录/翻译系统
耦合转录/翻译系统通过将转录/翻译耦合到一个单管系统，为研究人员提供了节省时间的真核生物体外转录和翻译替代方案。标准兔网织红细胞裂解液或小麦胚芽提取物的翻译(7)使用体外合成的RNA(8)。然后将RNA用作翻译模板。像TnT®系统通过将转录所需的试剂直接合并到翻译混合物中，绕过了许多这些步骤。
在大多数情况下TnT®系统反应在1- 2小时内产生的蛋白质(2- 6倍)比标准的体外兔网织细胞裂解物或小麦胚芽提取物用RNA模板翻译的蛋白质多得多。此外,TnT®裂解物也可用于微粒体膜研究加工事件。
微粒体囊泡被用于研究蛋白质的共翻译和最初的翻译后处理(9;10;11)。在微粒体膜存在的情况下，可以通过在体外翻译适当的mRNA来检测信号肽裂解(12)、膜插入(13)、易位和核心糖基化(14)等处理事件。加工和糖基化事件也可以通过适当DNA的转录/翻译来研究。
兔网状细胞裂解液系统的替代品包括小麦胚芽系统和使用昆虫细胞系提取物的系统，如常用的Spodoptera frugiperdaSf21细胞系(15)，我们的TnT®T7昆虫细胞提取蛋白表达系统(猫。# L1101，L1102)．小麦胚芽提取物为基础的无细胞蛋白合成比其他无细胞裂解物具有独特的优势，包括室温培养、高通量筛选的能力、添加辅助成分的灵活性、对细胞毒性蛋白的表达以及蛋白质折叠和功能的筛选(16;17)。
TNT®快速耦合转录/翻译系统
这个Master Mix的组件已经被仔细调整，以最大化表达和大多数基因结构的保真度。必要时，醋酸镁和氯化钾可用于优化体外翻译反应与T n T ®快速系统。
的包容RNasin®核糖核酸酶抑制剂直接在Master Mix中，可以防止使用一些迷你准备协议制备的DNA溶液中携带的rna的引入带来的潜在灾难。
原核无细胞蛋白表达
大肠杆菌S30提取系统
通常情况下,大肠杆菌S30片段用于原核表达。虽然系统的选择不应该仅仅由目标蛋白的来源来决定，还应该由蛋白质的生物学性质和下游应用的要求来决定。收益率大肠杆菌基于蛋白质的系统可能比基于真核的系统大得多，根据蛋白质和反应形式，通常高达几毫克/毫升。
s30t7高产蛋白表达系统(猫。# L1110，L1115)是一个大肠杆菌基于萃取的无细胞蛋白合成系统。它通过提供一种含有T7启动子的质粒的提取物，简化了转录和翻译DNA序列，该提取物包含转录所需的T7 RNA聚合酶和翻译所需的所有必要成分。该系统可以在一小时内使用含有感兴趣序列、T7启动子和核糖体结合位点(RBS)的载体产生高水平的重组蛋白(每毫升反应可产生数百微克的重组蛋白)。
S30提取了大肠杆菌S30萃取系统是由Zubay (18;19;20)。对于使用线性模板的表达式(猫。# L1030)，该提取物是由大肠杆菌ompT内源性蛋白酶和离子蛋白酶活性缺乏的B株。这导致表达的蛋白质更稳定，否则如果在体内表达，它们将被蛋白酶降解(21;22)。当使用圆形模板DNA时，大肠杆菌S30萃取系统(猫。# L1020)可以产生较高的蛋白表达水平，而由于宿主编码阻遏子的作用，这些蛋白通常在体内表达水平较低(23)。优化的S30预混Plus提供了表达高水平重组蛋白所需的所有其他成分。
蛋白表达在大肠杆菌提取系统可用于多种功能转录和翻译研究。最常见的应用大肠杆菌S30提取系统是合成少量的放射性标记蛋白质在蛋白质纯化中用作示踪剂，并将非自然氨基酸纳入蛋白质结构研究中(24)。
无细胞蛋白表达系统的应用
无细胞蛋白表达系统也是制造蛋白质阵列的有价值的工具。蛋白质微阵列是固相配体结合分析系统，用于跟踪蛋白质活性和相互作用，并以高通量形式确定蛋白质功能。传统的以细胞为基础的蛋白质芯片的生产是一个劳动密集型的过程，需要表达和纯化每个单独的蛋白质，然后进行排列。另一个缺点是固定化蛋白的长期功能稳定性通常是有限的。CFPS的使用可以通过直接并行合成多个蛋白质来规避这些挑战原位(片上)。
目前有几种不同类型的蛋白质微阵列被用于研究，包括PISA(蛋白质原位阵列)，NAPPA(核leyu体育靠谱吗酸可编程蛋白阵列)和DAPA (DNA阵列到蛋白质阵列)。
比萨
PISA方法是第一种著名的无细胞原位蛋白微阵列技术，通过在溶液中无细胞表达直接从DNA片段中快速生产标记蛋白。为目标蛋白编码的单个DNA结构包含一个T7启动子、翻译起始和终止序列以及一个N-或c端标记序列。利用高保真TAQ聚合酶通过PCR或RT-PCR生成DNA结构，然后无细胞偶联转录和翻译表达所需的标记蛋白(25)。合成之后，通过载玻片表面的标签捕获涂层，同时捕获并原位固定蛋白质(26)。
软羊革
NAPPA是一种基于标签的技术，它将DNA模板生物素化，并固定在预先涂有亲和素和抗gst抗体(作为蛋白质捕获试剂)的载玻片上(27)。该阵列可用于用兔网织细胞裂解液或类似的CFPS系统原位表达靶向蛋白。翻译完成后，靶向蛋白被固定的抗体捕获在每个点上，形成一个蛋白阵列，其中每个蛋白与相应的表达质粒共定位(28)。
NAPPA方法在疾病生物标志物的表征和自身免疫性疾病的研究中具有特殊的价值。nappa生成的微阵列已被用于帮助识别新的抗体反应结核分枝杆菌蛋白质组学，有效定位8个具有结核病生物标志物价值的蛋白质(29)。NAPPA也被用于描述自身免疫性风湿性疾病强直性脊柱炎患者的自身抗体反应(30)，分析幼年特发性关节炎患者的循环和滑膜抗体(31)，以及检测乳腺癌中结合肿瘤抗原的抗体(32)。
防卫事业厅
DNA阵列到蛋白质阵列(DAPA)方法是一种根据需要从单个DNA阵列模板打印蛋白质阵列的方法。在这种方法中，包含一组编码一组标记蛋白的固定pcr扩增片段的载片与第二载片面对面组装，并预先涂上蛋白质标记捕获试剂。一个含有无细胞裂解物的渗透膜夹在两个载片表面之间，实现耦合转录和翻译。蛋白质合成源于固定DNA的斑点，合成的蛋白质通过膜扩散并在捕获载玻片表面固定，形成蛋白质阵列(33)。
难表达蛋白的表达
无细胞蛋白表达系统提供了一种方法来生产通常难以表达的功能蛋白，如膜蛋白、毒性蛋白和病毒蛋白。使用一个耦合的CFPS系统，在合适的氧化和折叠条件下，一个复杂的异四聚体和多个二硫桥接的IgG分子被成功和完整地组装起来(34)。各种无细胞系统也已成功用于体外合成膜蛋白，包括g蛋白偶联受体、表皮生长因子受体和ATP合成酶(35)。
体外翻译系统也被用于成功表达病毒蛋白、病毒样颗粒(VLPs)和疫苗抗原。在一项研究中，124恶性疟原虫我们在体外合成了感兴趣的基因，作为潜在的疟疾疫苗候选基因，结果成功合成了75%的可溶产物，而不需要密码子优化。leyu乐鱼网胞外大肠杆菌萃取系统已被应用于合成VLPs和疫苗，包括抗流感VLPs、B细胞淋巴瘤疫苗和抗乙型肝炎VLPs(35)。
体外系统已经有效地产生了传染性脑肌炎病毒(EMCV)，当补充犬粒体膜时，整个丙型肝炎病毒RNA的开放阅读框已经被正确地翻译和处理(5)。这些研究证明了无细胞表达系统的巨大潜力，不仅是了解病毒复制机制的宝贵工具，还可以作为疫苗发现的手段和大规模生产疫苗的潜在平台(5;35)。
蛋白质进化与酶工程“，
蛋白质是复杂的、多功能的分子，在细胞中有多种功能。定向蛋白质进化是一个在功能基因变异选择和基因多样化之间交替的循环过程，这可以作为一种手段来提高某些类型的蛋白质功能，如催化活性，结合亲和力和热稳定性(4;36)。几种独特的蛋白质定向进化技术，包括核糖体显示、mRNA显示和体外区隔化，在过去的30年里已经开发了体外翻译系统。与基于细胞的方法相比，这些体外技术提供了一些优势，包括遗传信息(基因型)与编码蛋白(表型)的有效链接和更广泛的文库大小范围。
核糖体展示
核糖体显示方法涉及从多肽DNA序列库中分离单个蛋白质。在体外翻译过程中，蛋白质-核糖体-mRNA (PRM)复合体通过将新生多肽连接到其编码mRNA(1)来建立。
然后通过固定化配体通过亲和结合捕获这个感兴趣的PRM，从中提取mRNA并逆转录回cDNA，按需要进行突变。这个过程也可以在不突变恢复的cDNA的情况下重复进行，作为从大群体中富集靶蛋白的一种手段(5)。
核糖体显示技术(图6)一直是抗体、转录因子、受体、蛋白酶、酶、新肽、标签序列和配体结合域和基序的体外选择和进化的流行方法(5)。核糖体显示也被用于蛋白质组学应用，导致了5'-非翻译区域序列的识别，提高了翻译效率(37)。以及对金黄色葡萄球菌cDNA文库的抗原蛋白的综合测定，该文库可作为潜在的候选疫苗(38)。
信使rna显示
在mRNA显示技术中，一个编码感兴趣多肽的大型DNA文库被转录到mRNA中。mRNA的3 '端被连接到一个短的单链DNA寡核苷酸上，它携带一个适配器分子，典型的是嘌呤霉素。修饰后的mRNA产物通过无细胞蛋白合成转译;嘌呤霉素进入核糖体，与新生多肽链形成肽键。然后通过逆转录生成cDNA，稳定核酸成分，便于选择后遗传信息的恢复。leyu体育靠谱吗该cDNA可以通过PCR扩增，用于进一步研究或其他用途(39)。
这种mRNA显示技术已成功应用于连接酶的定向进化以及来自人工随机序列库的atp结合域(40;41)。mRNA显示也被用于获得基于纤维连接蛋白III型支架的抗原结合蛋白，从而产生能够结合tnf - α(42)和识别特定内源性磷酸化IkBalpha(43)的高亲和力分子。
体外划分
体外区隔化(IVC)是一种定向进化的方法，其目的是将一个大型反应分解为许多微观区隔，这些区隔将DNA及其相关的mRNA和蛋白质封装在油包水乳剂微滴或微珠表面。除了所有必需的分子成分外，每一个液滴都包含一个基因，这些分子成分随后被转录和翻译。表达所需活性的蛋白质将底物转化为与基因相连的产物，因为它们完全局限于微液滴中。与产物相关的基因要么被选择性地富集、扩增和表征，要么被连接回底物，并通过区隔化进行额外的筛选。IVC策略已成功应用于多种酶的工程，包括甲基转移酶、聚合酶和限制性内切酶(5;44)。
目前有多种高通量筛选方法，所有这些方法都能够简化传统的筛选过程。这些筛选方法包括微量滴定板、数字成像、荧光激活细胞分选(FACS)、细胞表面显示、IVTC和共振能量转移(46)。
体外翻译后的筛选已广泛应用于医疗应用，使蛋白质截断测试(PTT)的发展成为可能(图7)，它利用开放阅读框对翻译终止突变引起的遗传疾病进行诊断(5)。无细胞蛋白表达系统也使毒性试剂的筛选(47)和翻译抑制剂作为潜在药物的识别(48)成为可能。通过体外蛋白表达筛选和生产潜在候选疫苗，发现了一些有效的疫苗，可以保护小鼠免受肿瘤的伤害，其效果与在哺乳动物细胞中产生的疫苗相同(49)。
蛋白质标记与检测
检测使用无细胞系统表达的蛋白质对于大多数应用是必要的，如蛋白质:蛋白质相互作用和蛋白质:核酸相互作用研究。leyu体育靠谱吗传统上,放射性(35S]蛋氨酸被加入到无细胞表达反应中，并与表达的蛋白质结合，允许通过放射自显影检测。由于高成本、法规、放射性暴露和废物处理问题，许多研究人员正在远离放射性。传统的西方印迹分析为研究人员提供了一种非放射性的检测方法，但如果操作不当，可能会导致高背景。然而，检测方法如FluoroTect™Green利斯河体外翻译标记系统(猫。# L5001)和Transcend™非放射性翻译检测系统(猫。# L5070,L5080)允许敏感检测和低背景的Western blotting(50)。
FluoroTect™系统使用带有赖氨酸的tRNA，该tRNA用BODIPY标记在e位置®fl荧光团。这些荧光标记的赖氨酸残基在体外翻译过程中被合成到蛋白质中。Transcend™系统依赖于在翻译过程中将生物素化赖氨酸残基合并到新生蛋白质中。生物素化赖氨酸作为带电电子标记生物素化赖氨酸:tRNA复合体(Transcend™tRNA)添加到转译反应中，而不是游离氨基酸。经过sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和电印迹后，通过结合Streptavidin-AP或Streptavidin-HRP，分别进行比色法或化学发光检测，可见生物素化蛋白。通常，这些方法可以检测0.5-5ng的蛋白质，其灵敏度等同于[35S]蛋氨酸掺入和放射自显影检测。
Transcend™非放射性平移检测系统
Transcend™非放射性翻译检测系统能够对体外合成的蛋白质进行非放射性检测。使用该系统，生物素化赖氨酸残基在翻译过程中被合并到新生蛋白质中，不需要用[35蛋氨酸或其他放射性氨基酸。生物素化赖氨酸作为预带电的电子标记生物素化赖氨酸-tRNA复合体(Transcend™tRNA)加入转译反应，而不是游离氨基酸。经过SDS-PAGE和电印迹后，生物素化的蛋白质可以通过结合链亲和素-碱性磷酸酶(Streptavidin-AP)或链亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)来可视化，然后进行比色法或化学发光检测。一般情况下，凝胶电泳后3-4小时内可检测到0.5-5ng蛋白。该灵敏度与[35S]蛋氨酸掺入和凝胶电泳后6-12小时放射自显影检测。有关详细的协议和背景信息，请参见技术通报# TB182．
Transcend™tRNA的使用具有以下几个优点:
- 不需要处理、储存或处置放射性同位素。
- 生物素标记可检测(0.5-5ng灵敏度)。
- 生物素标签是稳定的12个月，无论是作为Transcend™tRNA试剂和标记的蛋白质。不需要定期重新合成生物素标记的蛋白质，不像[35S]-标记的蛋白质，其标记会随着时间的推移而衰减。
- 标记的蛋白质被检测为锋利的凝胶带，无论标记的强度或在凝胶上加载的数量如何，因此允许检测低表达的基因产物。leyu乐鱼网
- 使用比色法或化学发光检测，结果可以快速可视化。
预先充电的大肠杆菌该系统中提供的赖氨酸trna已使用Johnson开发的方法的修改在e-氨基上进行了化学生物素化et al。(1976)。生物素部分通过一个分隔臂与赖氨酸连接，这大大方便了亲和素/链亲和素试剂的检测(图8)。由此产生的生物素化赖氨酸tRNA分子(Transcend™tRNA)可用于真核或原核生物的体外翻译系统，如TNT®偶联转录/翻译系统，兔网状细胞裂解物，小麦胚芽提取物或大肠杆菌S30提取(52)。赖氨酸是最常用的氨基酸之一。平均而言，赖氨酸占蛋白质氨基酸的6.6%，而蛋氨酸只占1.7%(53)。
生物素化赖氨酸掺入对表达水平和酶活性的影响
赖氨酸残基在大多数蛋白质中很常见，通常暴露在面向水的表面。生物素化赖氨酸的存在可能会也可能不会影响修饰蛋白的功能。在凝胶位移实验中，c-Jun合成了TNT®用Transcend™tRNA标记的网织细胞裂解反应与未标记的c-Jun表现相同(54)。
估计生物素化赖氨酸的掺入水平
在蛋白质中加入放射性标记的氨基酸通常以添加标签的百分比来量化。这一价值可以包括将放射性并入假基因产物，如截断多肽。leyu乐鱼网因此，掺入率值只能提供合成的全长蛋白数量的粗略估计，并不能提供翻译保真度的任何信息。在Transcend™tRNA反应中，很难直接确定生物素-赖氨酸并入翻译蛋白的百分比。评估Transcend™tRNA反应中翻译效率和保真度的另一种方法是确定SDS-PAGE后可检测到的最小产物量。leyu乐鱼网在所有测试的情况下，我们在50µl翻译反应的1µl中检测到翻译产物，使用的Transcenleyu乐鱼网d™tRNA只有0.5µl(图9)。生物素的加入量随着Transcend™tRNA添加量的增加而线性增加，在大约2µl时达到最大值。
生物素化蛋白的捕获
使用生物素结合树脂(如SoftLink™软释亲和素树脂)可从转译反应中去除生物素化蛋白(猫。# V2011，V2012)．含有多种生物素的新生蛋白质与SoftLink™树脂强烈结合，不能使用“软释放”非变性条件洗脱。然而，SoftLink™树脂作为免疫沉淀的替代品是有用的。
翻译产物的比色法和化学发光检测leyu乐鱼网
含有生物素的翻译产物可以用两种方法分析。产物可以通过SDS-PAGE直接分解，转移到适当的膜上，通过比色法或化学发光反应进行检测(图10)。或者，可以使用生物素结合树脂(如SoftLink™树脂)从转译混合物中捕获生物素化蛋白。这种方法可以替代蛋白质复合物的免疫沉淀。
绿色的FluoroTect™利斯河体外翻译标记系统
绿色的FluoroTect™利斯河体外翻译标记系统使用带有荧光团BODIPY标记的带电赖氨酸tRNA分子®-FL在赖氨酸的(e)氨基酸位置(图11)。在FluoroTect™系统中，选择赖氨酸作为标记氨基酸是因为赖氨酸是使用频率较高的氨基酸之一，平均占蛋白质氨基酸的6.6%。使用基于激光的荧光凝胶扫描仪，在2-5分钟内直接“凝胶内”完成标记蛋白的检测。这消除了对蛋白质凝胶操作的任何要求，如固定/干燥或任何安全、监管或废物处理问题，如与使用放射性标记氨基酸有关的问题。非同位素“凝胶内”检测的便利性也避免了传统非同位素体系耗时的电印迹和检测步骤。有关该系统的详细协议和背景信息，请参阅技术通报# TB285．
参考文献
Zahnd C。et al。(2007)核糖体展示:在体外选择和进化特定结合靶点的蛋白质。Nat。方法。4 (3),269 - 79。
- Ginsburg, J.(2009)破译遗传密码:国家历史性化学地标。有关资料可于以下网址浏览:https://www.acs.org/content/acs/en/education/whatischemistry/landmarks/geneticcode.html#poly-u-experiment．
- 卡尔森,E。et al。(2012)无细胞蛋白合成:应用成熟。Biotechnol。睡觉。30日(5), 1185 - 1194。
- Chong, S.(2014)无细胞蛋白合成概述:历史地标、商业系统和扩展应用。咕咕叫。Protoc。摩尔。杂志。108, 16.30.1-11。
- He, M.(2008)无细胞蛋白合成:在蛋白质组学和生物技术中的应用。新的生物技术．25 (2 - 3), 126 - 132。
- 赫斯特，R.(2011)无细胞表达的创新应用。Promega公司网站，访问2019年6月。
- Pelham, H.R.B.和Jackson, R.J.(1976)网织细胞裂解物中高效的依赖mrna的翻译系统。欧元。学生物化学j。67247 - 56。
- Krieg, P.和Melton, D.(1984)功能信使rna由SP6在克隆cdna的体外转录中产生。诊断。酸Res。12, 7057 - 70。
- 兰多，R.R.(1996)蛋白质异戊烯酰化/甲基化的化学生物学。Bichimica Biophysica学报。1300, 5-16
- 汉K.-K。和Martinage, A.(1992)蛋白质的翻译后化学修饰。Int。学生物化学j。24, 19-28。
- 周润发,M。et al。(1992)蛋白质脂质修饰的结构及其生物学效应。咕咕叫。当今。细胞生物。4629 - 36。
- 麦克唐纳,核磁共振et al。(1988) - -， - -和- -前分泌肾上腺素的翻译后处理。无细胞翻译和早期翻译后处理事件。生物。化学。263, 15176 - 83。
- 雷,R.B.et al。(1995)丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞和病毒启动子的转录调控。病毒的研究。37, 209 - 20所示。
- Bocco J.L.et al。(1988)人胎盘poly(a +) mRNA的SP1前体在无细胞系统中的加工。摩尔。杂志。报告。13, 45-51。
- Ezure, T。et al。(2006)昆虫细胞冻融法制备无细胞蛋白合成体系。Biotechnol。掠夺。22, 1570 - 7所示。
- 盛田昭夫,再见et al。(2003)小麦胚芽无细胞系统是一种筛选蛋白质折叠和功能的新方法。蛋白质科学。12, 1216 - 21所示。
- Vinarov, D.A.et al。(2004)基于核磁共振的结构蛋白质组学的无细胞蛋白生产和标记方案。自然的方法。12149 - 53年。
- Zubay, G.(1973)微生物系统中蛋白质的体外合成。为基础。启麝猫。7, 267 - 87。
- 祖贝，G.(1980)分解代谢基因激活剂CAP的分离和性质。冰毒。Enzymol。65, 856 - 77。
- 莱斯利,S.A.et al。(1991)利用聚合酶链式反应生成的模板体外合成蛋白质研究大肠杆菌转录因子与核心RNA聚合酶和单克隆抗体表位定位。生物。化学。2662632 - 8。
- 普拉特，J.M. (1984)转录和翻译哈内斯，B.D.和希金斯，s.j.，编。英国牛津IRL出版社。
- 研究人员，F.W.和Moffatt, b.a(1986)使用噬菌体T7 RNA聚合酶指导克隆基因的选择性高水平表达。j·摩尔,杂志。189, 113 - 30。
- Collins, J.(1979)编码ColE1的动员功能和Tn3的转位功能的蛋白质的无细胞合成。基因。6, 29-42。
- 诺尔,C.J.et al。(1989)非自然氨基酸在蛋白质中位点特异性结合的一般方法。科学。244182 - 8。
- 与非,。et al。(2012)新兴的原位细胞自由表达蛋白微阵列技术。蛋白质和细胞。3 (2), 84 - 88。
- He, M.和Taussig, M. j .(2001)通过无细胞表达和原位固定从DNA中单步生成蛋白质阵列(PISA方法)。leyu体育靠谱吗核酸Res．29日(15)药剂。
- Manzano-Román, R.和Fuentes, M.(2019)核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)可用leyu体育靠谱吗性的十年:新闻、参与者、进展、前景和获取。j .蛋白质组学。198, 27岁- - - - - -35.
- Berrade, L。等．(2011)蛋白质微阵列:新发展和应用。制药。Res。28日(7), 1480年- - - - - -1499.
- 歌,L。et al。(2017)利用高密度核酸可编程蛋白阵列鉴定结核病血清学抗体靶点。leyu体育靠谱吗摩尔。细胞。Proteom．16, 277 - 289。
- 赖特,C。等．(2012)利用核酸可编程蛋白阵列检测强直性脊柱炎患者的多种自身抗体。leyu体育靠谱吗摩尔。细胞。蛋白质组学。11 (2), M9.00384。
- 吉布森,D。et al。(2012)利用核酸可编程蛋白阵列对幼年关节炎患者的循环和滑膜抗体谱分析。leyu体育靠谱吗关节炎研究与治疗。14, R77。
- 安德森,K.S.等．（2008）蛋白质微阵列在乳腺癌肿瘤抗原抗体多重检测中的应用．j .蛋白质组Res．，7，1490- - - - - -1499.
- 他,M。et al。(2008)从DNA阵列打印蛋白质阵列。自然方法．5, 175年- - - - - -177.
- Frey年代。et al。(2007)原核无细胞表达系统中功能完整的IgG的合成和表征。医学杂志。化学。389, 37-45。
- 佩雷斯,J。et al。(2016)无细胞合成生物学:超越细胞的工程。冷泉哈布。教谕。医学杂志．8 (12), a023853。
- Packer, M.和Liu, D.(2015)蛋白质定向进化的方法。自然遗传学评论．16, 379 - 394。
- 米氏,M。等．(2008)通过核糖体展示选择翻译效率高的mRNA 5’-未翻译区域序列。物化学。Biophys。Commun >,373, - 52。
- Weichhart, T。等．(2003)疫苗候选肽的功能筛选金黄色葡萄球菌体外全基因组表达库。感染。Immun．71, 4633 - 4641。
- Lipovsek, D.和Plückthun, A.(2004)通过核糖体显示和mRNA显示的体外蛋白质进化。j . Imm。方法。290 (1 - 2), 51 - 67。
- Keefe, ad和绍斯塔克，J.W.(2001)功能蛋白随机序列库。自然．410, 715 - 718。
- Seelig, B.和绍斯塔克，J.W.(2007)从部分随机的非催化支架中选择和进化酶。自然．448, 828 - 831。
- 徐,L。等．(2002)利用mRNA显示定向进化高亲和力抗体模拟物。化学．医学杂志。9, 933 - 942。
- 奥尔森c.a等．(2008)高亲和力、修饰特异性的磷酸化ikappabalpha结合纤维连接蛋白的mRNA显示选择。ACS化学。医学杂志．3 (8)480 - 5。
- 米勒,O。等．(2006)体外分隔的定向进化。自然方法．3., 561 - 570。
- Contreras-Llano, L.和Tan, C.(2018)利用无细胞基因表达系统进行生物分子的高通量筛选。Synth。生物。3 (1), ysy012。
- Xiao, H. et .(2015)定向酶进化的高通量筛选和选择方法。印第安纳州,Eng。化学。Res．54 (16), 4011 - 4020。
- 魏,Q。et al。(2005)用微型体外蛋白表达阵列检测毒素。肛交。化学．77, 5494 - 5500。
- 布,L。et al。(2007)综述:识别专门针对翻译的化合物的方法。Enzymol方法。431, 229 - 267。
- 坎特,G。et al。(2007)无细胞生产单链抗体融合蛋白:一种生产个性化淋巴瘤疫苗的有效方法。血．109, 3393 - 3399。
- Hook, B.(2011)在无细胞表达系统中表达的蛋白质的非放射性检测。Promega公司网站，访问2019年6月。
- 约翰逊,A.E.et al。(1976)尼西隆-乙酰赖氨酸转移核糖核酸:氨基酰基转移核糖核酸的生物活性类似物。leyu体育靠谱吗物化学。15, 569 - 75。
- Kurzchalia,电视et al。(1988) trna介导的生物素蛋白标记。一种非放射性检测细胞游离翻译产物的方法。leyu乐鱼网欧元。学生物化学j。172663 - 8。
- 戴霍夫，M.O. (1978)蛋白质序列与结构图谱，2国家生物医学研究基金会，华盛顿特区。
- 克罗利,K.S.et al。(1993)在易位早期，信号序列通过核糖体隧道进入内质网膜的非细胞质水环境。细胞。73, 1101 - 15所示。
