蛋白质纯化方法

蛋白质是维持细胞结构和功能完整性的生物大分子，许多疾病都与蛋白质功能障碍有关。蛋白质纯化是分析单个蛋白质和蛋白质复合体以及识别与其他蛋白质(DNA或RNA)相互作用的基本步骤。多种蛋白质纯化策略的存在，以满足所需的规模，吞吐量和下游应用。最优方法往往必须通过经验来确定。

蛋白质纯化

最佳的蛋白质纯化方案不仅取决于被纯化的蛋白质，还取决于许多其他因素，如用于表达重组蛋白的细胞(例如，原核细胞与真核细胞)。大肠杆菌由于使用方便，细胞生长快，培养成本低，仍然是许多研究人员生产重组蛋白的首选。蛋白质表达大肠杆菌可以大量纯化，但这些蛋白，特别是真核蛋白，可能没有表现出适当的蛋白质活性或折叠。培养的哺乳动物细胞可能为产生具有适当翻译后修饰的正确折叠和功能的哺乳动物蛋白质提供了更好的选择(Geisse等．1996)。然而，重组蛋白在培养的哺乳动物细胞中的低表达水平给其纯化带来了挑战。因此，获得令人满意的产量和纯度依赖于从粗细胞裂解物中高度选择性和高效地捕获这些蛋白质。

为了简化纯化，亲和纯化标签可以融合到感兴趣的重组蛋白上(Nilsson等．1997)。常见的融合标签是多肽，小蛋白或酶添加到重组蛋白的N或c端。不同标签的生化特征影响其所附着蛋白质的稳定性、溶解度和表达(Stevenset al。2001)。使用包含融合标签的表达载体可以促进重组蛋白的纯化。

蛋白质复合物的分离

蛋白质组学的一个主要目标是阐明蛋白质的功能和负责关键细胞过程的复杂网络的组织。蛋白质相互作用分析:蛋白质相互作用可以提供对这些过程中涉及的细胞信号级联的有价值的洞察，蛋白质:核酸相互作用分析通常揭示有关生物过程的重要信息，如mRNA调控，染色体重塑和转录。leyu体育靠谱吗例如，转录因子通过与染色体上特定的识别位点(通常在基因的启动子上)结合，并与细胞核中的其他蛋白质相互作用，在调节转录方面发挥着重要作用。这种调节是细胞活力、分化和生长所必需的等．2009;天啊等．1998）．

蛋白质的分析:蛋白质的相互作用通常需要直接的方法，以适当的方向固定在固体表面上，而不破坏蛋白质的结构或功能。这种固定不能干扰绑定能力，可以通过使用亲和标记来实现。在芯片上固定蛋白质是分析蛋白质:DNA和蛋白质:蛋白质相互作用和识别蛋白质复合物成分的流行方法(霍尔等．2004;大厅et al。2007;Hudson和Snyder, 2006)。功能蛋白微阵列通常包含与固体表面结合的全长功能蛋白或蛋白质结构域。荧光标记的DNA用于探测阵列，并识别与特定探针结合的蛋白质。蛋白质微阵列为蛋白质的高通量鉴定提供了一种方法:DNA相互作用。固定化蛋白质也可用于蛋白质下拉试验，以分离体内(哺乳动物细胞)或体外蛋白质结合伙伴。其他下游应用，如质谱分析，不需要蛋白质固定化来识别蛋白质伙伴和蛋白质复合体的单个成分。

哺乳动物细胞中缺乏内源性的HaloTag®蛋白，从而降低了检测假阳性或非特异性相互作用的机会。共价捕获和快速结合动力学的结合克服了与传统亲和标记相关的基于平衡的限制，即使在低表达水平也能有效捕获。此外，高度稳定的HaloTag®蛋白:配体相互作用允许在SDS- page分析之前在SDS样品缓冲液中煮沸蛋白质复合物。

多组氨酸标记蛋白的纯化

用磁性树脂快速纯化多组氨酸标记蛋白

对高通量蛋白质纯化方法的需求越来越大。磁性树脂使亲和性标记蛋白纯化不需要多个离心步骤和连续转移样品到多个管。定义一个好的蛋白纯化树脂有几个标准:最少的非特异性蛋白结合，对融合蛋白的结合能力高，融合蛋白的高效回收。MagneHis™蛋白质纯化系统满足这些标准，能够纯化具有广泛分子量和不同表达水平的蛋白质。结合颗粒的磁性使得从粗裂解物中提纯可以在单管中进行。此外，该系统可与自动化液体处理平台一起用于高通量应用。

MagneHis™蛋白质纯化系统

的MagneHis™蛋白质纯化系统使用顺磁预荷镍颗粒(MagneHis™Ni-Particles)直接从粗细胞裂解液中分离出多组氨酸标记蛋白。图2显示了MagneHis™蛋白质纯化系统协议的示意图。多组氨酸标记蛋白可以在小范围内用不到1毫升的培养物纯化，也可以在大范围内用超过1升的培养物纯化。样品可以使用Beckman Coulter Biomek®FX或Tecan Freedom EVO®仪器等机器人平台以高通量的方式进行处理。多组氨酸标记蛋白可以在天然或变性(2-8M尿素或胍-盐酸)条件下纯化。在哺乳动物和昆虫细胞培养基中血清的存在不干扰纯化。有关更多信息和详细协议，请参阅技术手册#TM060和MagneHis™蛋白质纯化系统自动化协议。

方案:MagneHis™纯化细菌细胞中表达的蛋白质

材料要求:

• MagneHis™蛋白质纯化系统和协议
• 37°C培养瓶或试管
• 瓶
• 磁选站
• 1M咪唑溶液(pH 8.0;用于从昆虫或哺乳动物细胞或培养基中纯化)
• 额外的结合/洗涤缓冲液(如果处理大量昆虫细胞、哺乳动物细胞或培养基样本，可能需要)
• 固体氯化钠(用于从昆虫或哺乳动物细胞或培养基中纯化)

使用变性条件净化。在细菌细胞中表达的蛋白质可能存在于不溶性包涵体中。要确定蛋白质是否位于包涵体中，请执行裂解步骤FastBreak™细胞裂解试剂， 10X，如技术手册#TM060所述。离心分离细胞碎片，凝胶分析上清和颗粒中多组氨酸标记蛋白。

高效纯化不溶性蛋白需要变性条件。由于多组氨酸标记的融合蛋白与MagneHis™Ni-Particles的相互作用不依赖于第三层结构，所以融合蛋白可以通过向细胞中添加强变性剂(如2-8M盐酸胍或尿素)来捕获和纯化。在整个过程中必须使用变性条件，以使蛋白质不会聚集。我们建议通过直接向MagneHis™结合/洗涤和洗脱缓冲液中添加固体盐酸胍或尿素来制备变性缓冲液。有关更多信息，请参见技术手册#TM060。

注意:请勿将FastBreak™细胞裂解试剂与变性剂混合使用。细胞可以直接用尿素或盐酸胍等变性剂裂解。

昆虫和哺乳动物细胞的纯化．以2 × 10的细胞密度加工细胞⁶细胞/毫升的文化。贴壁细胞可通过刮取和重悬于此密度的培养基中从组织培养容器中除去。细胞可在含有高达10%血清的培养基中加工。处理超过指示数量的细胞每毫升样品可能导致蛋白质产量减少和增加非特异性结合。对于分泌到细胞培养基中的蛋白质，在提纯之前从培养基中去除任何细胞。有关更多信息，请参见技术手册#TM060。

用磁性树脂快速纯化gst标记蛋白

对高通量筛选的蛋白质纯化方法的需求越来越大。磁性树脂使亲和性标记蛋白纯化不需要多个离心步骤和转移样品到多个管。定义一个好的蛋白纯化树脂有几个标准:最少的非特异性蛋白结合，对融合蛋白的结合能力高，融合蛋白的高效回收。的MagneGST™蛋白质纯化系统满足这些标准，使纯化具有广泛分子量和不同表达水平的蛋白质成为可能。结合颗粒的磁性性质允许在单管中从粗裂解液中提纯。此外，该系统可与自动化液体处理平台一起用于高通量应用。我们建议使用手动协议作为为自动化工作站开发协议的指南。

MagneGST™蛋白质纯化系统

MagneGST™蛋白纯化系统提供了一种简单、快速和可靠的方法来纯化谷胱甘肽- s -转移酶(GST)融合蛋白。顺磁性颗粒固定化谷胱甘肽(MagneGST™谷胱甘肽的粒子)用于直接从粗细胞裂解液中分离gst融合蛋白，使用手动或自动程序。顺磁颗粒的使用消除了几个离心步骤和多管的需要，并最大限度地减少样品材料的损失。虽然MagneGST™系统是为人工应用设计的，但样品可以使用机器人平台进行处理，如Beckman Coulter Biomek®FX工作站，用于高通量应用。

使用提供的MagneGST™细胞裂解试剂或替代裂解方法裂解含有gst融合蛋白的细菌细胞，并将MagneGST™颗粒直接添加到粗裂解液中。gst融合蛋白与MagneGST™颗粒结合。未结合的蛋白质被洗掉，用50mM谷胱甘肽洗脱gst融合靶蛋白。图5显示了MagneGST™蛋白质纯化系统协议的示意图。

HaloTag®蛋白从哺乳动物细胞纯化

培养的哺乳动物细胞提供了一个非常适合产生具有适当翻译后修饰的折叠和功能的哺乳动物蛋白质的环境。然而，重组蛋白在培养的哺乳动物细胞中的低表达水平提出了一个挑战。因此，获得满意的产量和纯度取决于从粗细胞裂解液中选择性和有效地捕获这些蛋白质。大多数亲和标记蛋白纯化方法的平衡结合意味着蛋白质不断地在结合态(到树脂)和非结合态之间进行交换。这种平衡取决于蛋白质浓度和标签的结合亲和力。因此，在低表达水平时，结合效率可能降低，导致融合蛋白的回收率低。

的HaloTag®哺乳动物蛋白纯化系统(猫。# G6795和猫。# G6790)使用的是HaloTag®蛋白标签，它可以与任何蛋白质基因融合，并在哺乳动物细胞中短暂或稳定表达。细胞裂解后，HaloTag®融合蛋白被共价捕获在HaloLink™树脂上，非特异性蛋白被洗去。在连接HaloTag®蛋白标签和目标蛋白的氨基酸连接子序列中，特定的TEV识别位点上的蛋白水解裂解释放出目标蛋白。为了消除需要第二步来去除蛋白酶，TEV蛋白酶融合到HaloTag®(HaloTEV蛋白酶；猫。# G6601)可用于切割HaloTag®融合蛋白，然后共价捕获在HaloLink™树脂上，从而形成一个流线型的纯化过程。这种简单的净化方法在整个过程中使用单一的、温和的生理缓冲液，不需要交换缓冲液。

HaloTag®蛋白纯化大肠杆菌

的HaloTag®蛋白纯化系统(猫。# G6280)允许共价、高效和特异性捕获表达的蛋白大肠杆菌作为n端HaloTag®融合蛋白。HaloTag®蛋白非常适合从哺乳动物细胞中纯化蛋白质的许多相同的特性也使它成为纯化蛋白质的一个很好的选择大肠杆菌细胞。HaloTag®融合蛋白可在大肠杆菌使用一些专门设计的表达载体大肠杆菌包括pFN18A HaloTag®T7 flexxi®Vector (Cat。# G2751)和pFN18K HaloTag®T7 flexxi®Vector (Cat。# G2681)以及非flexi®载体，它们具有HaloTag®蛋白质和聚组氨酸的双重标记。这些非flex®载体，pH6HTN His6HaloTag®T7载体(Cat。# G7971)和pH6HTC His6HaloTag®T7矢量(Cat。# G8031)，允许使用多个克隆站点进行传统克隆。这些双标记载体使HaloTag®融合蛋白的纯化能够保持HaloTag®蛋白的共价偶联能力。使用HaloTag®蛋白纯化系统，可以很容易地使用荧光HaloTag®配体进行凝胶内检测和蛋白表达水平的量化。

1. 阿姆斯特朗，R.N.(1997)谷胱甘肽转移酶的结构、催化机制和进化。化学。Toxicol >,10,最近。
2. Geisse, S。et al。(1996)真核表达系统的比较。蛋白质Expr。Purif。8, 271 - 82。
3. 天哪,S。et al。(1998) NFκB和Rel蛋白:进化保守的免疫反应介质。为基础。启Immunol。16225 - 60。
4. 大厅,D.A.et al。(2007)蛋白质微阵列技术。动力机械。老化的开发。128, 161 - 7所示。
5. 大厅,D.A.et al。(2004)代谢酶对基因表达的调控。科学306, 482 - 4所示。
6. Hudson, M.E.和Snyder, M.(2006)调控元素发现的高通量方法。生物学技术41, 673 - 81。
7. Hutchens, T.W.和Yip, T.T.(1990)多肽和蛋白质表面结构与自由金属离子和表面固定化金属离子的微分相互作用。j . Chromatogr。500531 - 42。
8. 过w•b西博尔德作品Kaelin,et al。(1991)视网膜成母细胞瘤基因产物的T/ e1a结合区特异性相互作用的细胞蛋白的鉴定。细胞64521 - 32。
9. Lonnerdal, B.和Keen, C.(1982)蛋白质的金属螯合亲和层析j:。物化学。4203 - 8。
10. Mankan, A.K.et al。(2009) NF-kappaB法规:核反应。j .细胞。摩尔。地中海。13, 631 - 43。
11. Mannervik, B.和Danielson, U.H.(1988)谷胱甘肽转移酶-结构和催化活性。CRC致命一击。学生物化学启。23, 283 - 337。
12. 尼尔森,J。et al。(1997)重组蛋白检测、纯化和固定化的亲和融合策略。蛋白质Expr。Purif。11硕士论文。
13. Porath J。et al。(1975)金属螯合亲和层析，蛋白质分离的新方法。自然258, 598 - 9。
14. 史密斯，D.B.和约翰逊，K.S.(1988)表达多肽的单步纯化大肠杆菌与谷胱甘肽s -转移酶融合。基因67, 31-40。
15. 史蒂文斯司令部et al。(2001)结构基因组学的全球努力。科学294, 89 - 92。
16. Terpe, K.(2002)标签蛋白融合概述:从分子和生化基础到商业系统。达成。Microbiol。Biotechnol。60, 523 - 33所示。
17. 和田,H。et al。(1998) NEDD8基因c端被UCH-L3切割。物化学。Biophys。Commun >,251, 688 - 92。
18. 王,Y。et al。(2000)神经元C2结构域蛋白的RIM/NIM家族。与Rab3的相互作用和一类新的Src同源结构域蛋白。生物。化学。275, 20033 - 44。
19. Yip电汇et al。(1989)用高性能固定金属离子亲和层析法评价多肽与Cu(II)、Ni(II)和Zn(II)的相互作用。肛交。物化学。183, 159 - 71。