基于pcr的病毒检测发展的考虑

任何病毒检测方法的发展都是从提取病毒核酸开始的。leyu体育靠谱吗选择一种方案可能具有挑战性，需要在不破坏核酸的情况下平衡化学分解病毒颗粒的能力，同时最大限度地回收遗传物质。leyu体育靠谱吗从血浆或血清到拭子或其他可能含有PCR抑制剂的介质，样品基质可能有很大差异。幸运的是，有各种各样的商业提取试剂盒可供已有协议的实验室使用。用户应该考虑他们是只想分离DNA还是RNA，还是全部的核酸。leyu体育靠谱吗根据起始材料的不同，预处理要求也可能有所不同。此外，实验室将需要根据样品处理需求，包括吞吐量、样品数量和所需时间，来决定手动和自动提取方法。对于自动化平台来说，找到适合现有通风罩的仪器对于最大限度地降低暴露风险也很重要。

分子检测分析最关键的部分是适当扩增针对目标病毒的特定序列。第一步将是设计引物序列，放大只存在于所选病毒的区域，并允许有效复制序列。这可能是一个困难和耗时的过程;然而，在许多情况下，主要的传染病实验室如疾病控制和预防中心(CDC)迅速公布了共识序列。例如,引物序列在中国发现首例病例后的两个月内，疾控中心就提供了2019- covid(2019新型冠状病毒)。

建立引物序列后，实验室应考虑能够快速、一致和有效扩增目标扩增子的PCR或qPCR试剂。鉴于大多数病毒是基于rna的，我们将重点选择实时RT-qPCR试剂集。商业上可用的产品可以分为1步和2步版本，允许用leyu乐鱼网户根据需要灵活地创建协议。然而，大多数实验室更倾向于使用1步RT-qPCR产物。建议将dUTP纳入扩增产物中，因为所得到的扩增物易被尿嘧啶- dna糖基化酶(UNG)降解;leyu乐鱼网允许用户在后续反应中加入UNG，以控制可能的遗留污染。分析设计人员也可能希望加入RNase抑制剂，以尽量减少靶标的损失。

识别目标的存在需要一种快速、可靠的探测方法。实时qPCR仪器很容易从多个供应商获得，但应考虑到速度和颜色检测能力。如果每口井检测一个目标，简单的仪器就足够了，但随着分析变得越来越复杂(包括多个目标或内部控制)，就需要更复杂或更昂贵的仪器。必须考虑每个目标的信号平衡和对给定仪器上可用的滤波器组的适当染料选择。

对于任何检测方法，都需要适当的控制以确保检测按预期工作。对于阴性对照，建议井中含有已知阴性的核酸靶点，而不仅仅是水，因为在对照中排除任何核酸会错过非特异性引物结合或扩增的假阳性结果。leyu体育靠谱吗阳性对照可在检测管内部(使用替代序列或报告染料)或在与未知样品同时运行的单独孔中进行。合并内部阳性对照是确认检测各方面工作正常的最可靠方法，但由于多路复用可能导致灵敏度降低(1)。

随着任何分析方法的开发，用户必须验证测试是否按预期执行。测量精度(与参考技术相比)、精密度(结果可重复)、灵敏度(假阴性、特异性(假阳性)和检测范围。测试这些参数的指南可从乐鱼体育是什么分子病理学协会．

在开发用于病毒检测的测定方法时，有许多参数需要考虑。在建立了基础技术(提取方法、扩增试剂和检测方法)之后，对未来靶标的检测就更加直接了。利用已证实特性的现成商业产品将进一步加强这一进程。leyu乐鱼网然而，通过适当的计划和研究，实验室可以迅速创建一个可重复的方法。