灵敏度和串扰如何影响您的生物荧光检测结果

药物发现的各种应用都需要灵敏的定量分析。例如，研究细胞信号通路以开发和理解新的药物疗法需要能够区分转录、分子相互作用和细胞健康的微小变化的分析。研究转录可以包括转录因子启动子和增强子的特征，识别基因点突变或缺失，甚至是引起环境条件变化的细胞应激。要了解这些因素如何影响通路结果，就需要有能力监测实验样本和对照样本之间微小而微妙的差异。

发光、荧光和吸收是这些测定中最常用的三种方法。一般来说，发光测定法比荧光测定法更敏感，荧光测定法比吸收测定法更敏感。无论采用何种检测方法，检测目标中的低水平或微小变化都需要灵敏的检测方法。例如，在研究酶促反应时，你不希望必须添加高水平的底物酶或催化剂来将反应驱动到可检测的水平，因为这会创建一个不能反映生理条件的人工系统。相反，您希望您的分析足够敏感，以便在接近生理水平的情况下进行，从而生成更多生物学相关的数据。

高灵敏度可以让你检测到低灵敏度方法可能漏掉的样本，但是当你有一盘信号强度不同的实验样本时会发生什么呢?你怎么能确定来自一口井的检测信号不是来自邻近井的强信号的部分结果?在平板阅读器中，这被定义为井间串扰。

串扰是板的不透明度以及在读数过程中检测仪器将一个阱与另一个阱掩蔽或隔离的函数。发光研究通常在不透明的白色板中进行，以获得最大的发光输出。不幸的是，这些白色的盘子并不是完全防光的。一个井中的强发光信号将为相邻低信号或没有信号的井提供光(图1)。这就是为什么你不应该在一个负控制(低发光或没有发光)旁边的井中放置一个正控制(高发光)。

串扰的一个主要因素是发光读取器如何将被测井的信号与来自相邻井的信号隔离开来。井和测量装置之间的缝隙可以让杂散光进入探测器。为了避免这个问题，你可以设计你的实验，在你的样本之间有空白井，以避免相邻井的串扰。然而，这大大减少了你可以在微孔板上测量的样品数量。如果你可以选择使用低串扰的发光计，最好避免围绕平板阅读器的性能设计你的实验。

灵敏的检测也需要灵敏的检测平台。用于检测发光、荧光和吸光度信号的平板阅读器的灵敏度各不相同(图2)。影响仪器灵敏度或检测极限的因素包括来自探测器和电子设备的背景噪声、所使用的探测器类型以及仪器的配置和总体设计。降低仪器的背景提高了检测的极限，从而提高了信噪比，从每次实验中提供更多可用的数据。相反，高背景会掩盖低电平信号，减少每个实验的可用数据。为了获得细胞中生物学的真实情况，如果可能的话，在接近生理条件的情况下测量您的测定更有意义(图3)。

为了确定您可以从不同常用的微孔板阅读器中获得多少串扰，我们使用了激酶- glo®Max试剂(猫。# V6071)和水来组装板，在高发光孔附近没有样品孔。比较了水井中检测到的信号量，结果表明，仪器之间的串扰量差异很大(表1)。

人们很容易把注意力集中在分析的灵敏度上，而忘记了分析结果的灵敏度仅与仪器的检测水平相同。仪器和检测灵敏度的结合为您的实验提供了真实的检测水平。拥有一台具有必要灵敏度的仪器来实现您所需的检测水平意味着您将需要使用更少的样品，更少的酶和更少的催化剂来进行实验。你也可以检测到更少的细胞，更低的转录水平和分子相互作用中更微妙的变化。灵敏度比较(LOD和LOQ)之间的市售检测仪器GloMax®发现而且导航器显示出1至2个测井曲线的仪器灵敏度更好(图2)。低仪器背景和整体设计意味着每口井的检测结果由GloMax®工具让你有最好的机会在发光实验中测量接近生理水平。

市售检测仪器之间的串扰比较表明GloMax®发现在测试的仪器中显示出最少的串扰。该仪器的专有掩蔽设计，可以将目标井的信号与相邻井的信号隔离开来，这意味着该仪器可以对每口井的检测结果进行检测GloMax®微孔板阅读器可信赖，无需担心相邻井的信号。