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开发和测试NanoBRET™craft - braf相互作用分析

Laurence Delaurière和Katarzyna Dubiel
Promega公司
出版时间:2019年2月;tpub_203

摘要

CRAF和BRAF蛋白激酶在Ras-Raf-MAPK信号通路中发挥作用,并在肿瘤发生和癌症中发挥关键作用。激活和信号转导需要CRAF和BRAF激酶结构域的异二聚,BRAF突变可以促进MEK/ERK信号的组成性激活,导致不受控制的细胞增殖和肿瘤发生。在这里,我们提出了一种使用NanoBRET™检测HCT116和HEK293细胞系中craft - braf异二聚体的方法。我们证明了在选择性RAF抑制剂GDC-0879的存在下诱导二聚化以浓度依赖的方式发生。我们描述了分析开发中的关键成分,包括标签放置的优化。值得注意的是,我们强调了在分析优化过程中诱导剂(或抑制剂)包合的重要性。最后,我们使用HaloTag确认BRAF-CRAF蛋白:蛋白相互作用®下拉的方法。总之,我们提出了蛋白质的概述:使用NanoBRET™技术,以craft - braf相互作用作为模型系统开发蛋白质相互作用测定。

简介

RAF激酶作为细胞信号转导的关键中间产物,与细胞增殖、细胞存活和分化等关键细胞过程相关。BRAF和CRAF的异二聚导致Ras-Raf-MAPK通路的激活和信号转导。由于其重要的细胞作用和致癌特性,RAF激酶已在癌症的背景下被广泛研究。(1)(2)特定的BRAF突变导致下游MEK/ERK信号的组成性激活,与多种癌症有关,影响二聚化的BRAF抑制剂已证明与癌症治疗的临床相关性。(3)(4)GDC-0879,一种atp竞争性RAF抑制剂,被矛盾地发现诱导craft - braf二聚化并激活下游信号。(5)基于细胞的RAF激酶二聚体分析是理解GDC-0879等化合物的功能和作用机制的有用工具,并可以确定可以调节这种相互作用的其他化合物。

基于细胞的蛋白质相互作用研究的一种方法是生物发光共振能量转移(BRET),它使用生物发光供体和荧光受体来监测蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)。(6)具体来说,NanoBRET™PPI检测使用NanoLuc®荧光素酶作为BRET能量供体和HaloTag®用荧光HaloTag标记的蛋白质®NanoBRET™618配体(猫。# G9801)作为能量受体来测量活细胞中的蛋白质相互作用。(7)明亮的蓝移NanoLuc®供体信号和红移HaloTag®与传统BRET分析相比,受体创建了最小光谱重叠的最佳配对,增加了信号和较低的背景。

在设计新的NanoBRET分析方法时,优化实验条件对于实现最佳分析性能非常重要。(8)标签的方向和位置可以影响信号输出和蛋白质功能。我们建议您通过测试所有可能的供体和受体组合来优化NanoBRET™检测方法。感兴趣的蛋白质应该用NanoLuc标记®捐赠者或HaloTag®在氨基(N)或羧基(C)端的受体,导致4个变体和8个潜在的供体/受体组合。(8)此外,还应优化转染载体的比例,使动态范围最大化。

在这里,我们描述了用于监测CRAF和BRAF蛋白之间相互作用的NanoBRET™PPI检测的开发。在GDC-0879存在和不存在的情况下,我们系统地筛选所有可能的供体/受体组合。我们还优化了转染的供体-受体载体比例,并使用HaloTag验证相互作用®下拉试验。我们在人类胚胎肾(HEK293)和人类结肠癌细胞系(HCT116)两种细胞系中测试了相互作用试验,这两种细胞系在KRAS基因中有突变,经常被用作癌症模型和抑制剂研究。(9)这些步骤共同构成了NanoBRET™PPI检测开发的大纲。

方法

优化标签放置

为了确定BRET供体和受体的理想位置,在HCT116细胞和HEK293细胞中测试了8种可能的质粒组合,以检测craft - braf蛋白相互作用。标签放置和实验设置遵循了实验方案NanoBRET™Protein:Protein Interaction技术手册# TM439(8)简单地说,NanoLuc的C端和n端融合®捐赠者和HaloTag®受体同时放置在BRAF和CRAF上。用FuGENE共转染HCT116和HEK293细胞®HD转染试剂(猫。# E2311)与载体使用1:10(1µg:10µg)的供体与受体比例。(8)细胞被复制到含有或不含HaloTag(对照)的96孔板中®NanoBRET™618配体。为了诱导craft - braf相互作用,用10µM GDC-0879处理细胞亚群2小时。NanoBRET™NanoGlo®底物(猫。# N1571),在GloMax上测量供体和受体信号®发现仪器(猫。# GM3000)处理过和未处理的细胞。NanoBRET™信号归一化到缺乏HaloTag的井®NanoBRET™618配体的最佳检测窗口。在处理和未处理的细胞之间确定信号的折叠变化,以确定理想的标签放置。

优化转染

CRAF-HaloTag®和BRAF-NanoLuc®将载体以1:1的供受体比例共转染HCT116和HEK293细胞;1:10;1:100和1:100。如上所述,在GloMax上测量处理过的样品(10µM GDC-0879化合物)和未处理的样品®发现仪器。计算处理和未处理样品之间的每一个矢量比的折叠变化。

剂量-反应曲线

为了测量craft - braf相互作用的诱导,使用craft - halotag®和BRAF-NanoLuc®将载体共转染HCT116和HEK293细胞,用GDC-0879化合物处理,形成剂量-反应曲线。简单地说,细胞以供体与受体的比例1:1或1:10共转染。用GDC-0879化合物浓度从0.001 μ M到10 μ M处理细胞2小时。NanoBRET™测量和信号归一化如前所述。(8)

HaloTag™下拉检测

为了验证craft - braf蛋白相互作用,我们使用了改良的HaloTag®哺乳动物下拉试验(猫。# G6509)(图1),然后进行生物发光检测(Steffen和Méndez-Johnson 2019).简单地说,HCT116细胞与选择的HaloTag共转染®和NanoLuc®供体与受体比例为1:1的融合。用浓度为0,1µM或10µM的GDC-0879处理细胞。HaloTag®细胞裂解物中的蛋白融合用HaloLink™树脂(猫。# G1912),然后使用ProTEV Plus进行切割(猫。# V6101).copurification NanoLuc的信号®荧光素酶融合蛋白用Nano-Glo检测®荧光素酶测定(猫。# N1110).

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图1。修改HaloTag®哺乳动物下拉系统工作流程。细胞与HaloTag共转染®和NanoLuc®融合构建和裂解。的HaloTag®融合蛋白被固定在HaloLink™树脂上,并通过TEV裂解与相互作用的蛋白一起洗脱。Copurified NanoLuc®荧光素酶融合蛋白定量。

结果

确定NanoLuc的理想位置®捐赠者和HaloTag®在抑制剂存在或不存在的情况下,评估受体标签、多个载体组合的信号动态范围。使用NanoLuc的C端和n端融合共生成了4个结构®和HaloTag®BRAF和CRAF上的蛋白质,产生了8种可能的载体组合。转染HCT116和HEK293细胞株,其中一部分细胞用GDC-0879抑制剂复合物处理。由箭头标记的组合获得了最高的NanoBRET™信号,并随细胞类型而变化(图2)。重要的是,产生最高总信号的向量组合并不对应于处理和未处理样品之间的最大倍数变化的组合。由于特定的craft - braf相互作用仅发生在复合处理中,NanoLuc®和HaloTag®与最低基础水平的c端标记蛋白craft - halotag (craft - ht)和BRAF-NanoLuc (BRAF-NL)的融合在复合处理后提供了最大的折叠变化和最佳的检测窗口。因此,我们在所有进一步的实验中都使用了craft - ht和BRAF-NL融合。

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图2。标签放置优化。8种质粒组合获得的NanoBRET™比例和折叠变化。用N端或c端NanoLuc标记的CRAF和BRAF®(NL)或HaloTag®(HT)蛋白共转染HCT116细胞(板一个)或HEK293细胞(面板B),供体-受体DNA比为1:10,加或不加10µM GDC-0879化合物处理(n = 4)。

为了减少未结合供体的数量并最大化NanoBRET™信号的动态范围,我们在共转染期间优化了所选组合的供体-受体载体的比例。我们使用了HCT116和HEK293细胞株,并测试了1:1、1:10、1:100和1:10 000的供体-受体载体比例。再一次,用GDC-0879处理部分细胞以诱导相互作用。在两个细胞系上,供体与受体的比例为1:1时,获得了最高的折叠变化。进一步分析1:1和1:10的比例(图3)。

HT-CRAF和NL-BRAF矢量比优化

图3。矢量比优化。使用craft - halotag获得不同供体-受体比例下的NanoBRET™比例和折叠变化®和BRAF-NanoLuc®质粒。HCT116细胞(板一个)或HEK293细胞(面板B)分别以1:1、1:10、1:100或1:10 000的供体-受体DNA比例共转染,并使用或不使用10µM GDC-0879处理(n = 4)。

为了研究GDC-0879剂量对CRAF和BRAF异二聚的影响,在NanoBRET™实验中测量了不同浓度的化合物。分析供受体比为1:1和1:10的HCT116和HEK293细胞株。图4显示了两种矢量比的剂量-响应曲线。与之前的实验一致,1:1的载体比例获得了更大的动态范围,并且在两种细胞株中观察到类似的反应。这些数据表明,最有效的NanoBRET™检测需要对标签和载体比例进行优化。此外,一旦优化,NanoBRET™PPI分析可以作为蛋白质相互作用的高度定量测量,响应预期的化合物调节剂。

GDC-0879剂量-反应曲线

图4。GDC-0879剂量-反应曲线。在不同浓度GDC-0879化合物下获得的NanoBRET™craft - braf相互作用信号的折叠变化。HEK293细胞(板一个)或HCT116细胞(面板B)分别以1:1或1:10的供体-受体DNA比例共转染,并以指定浓度GDC-0879处理(n = 4)。

最后,为了确认craft - braf的相互作用,我们利用了HaloTag的另一种用途®和NanoLuc®蛋白质,并使用改良的HaloTag®哺乳动物下拉实验,然后对NanoLuc进行生物发光检测®融合。用不同浓度的抑制剂化合物刺激HCT116细胞二聚。经过蛋白质的下拉和裂解,纳米glo®荧光素酶检测用于检测任何与craft - ht共纯化的BRAF-NL。荧光素酶信号与HaloTag进行比较®控制向量。在没有GDC-0879的情况下,与HaloTag相比,我们观察到BRAF大约富集了10倍®(图5)。我们观察到,随着GDC-0879浓度的增加,BRAF的倍增富集显著增加。这些数据证实,在NanoBRET™实验中测量的能量转移是由于BRAF-NL和craft - ht融合蛋白之间的物理相互作用。

HaloTag下拉NL-BRAF

图5。HaloTag®BRAF-NL的下拉。NanoLuc的折叠富集®在0,1µM或10µM GDC-0879化合物存在时,共表达craft - ht与BRAF-NL的HCT116细胞的荧光素酶活性(n = 3)。

总结

在这里,我们介绍了NanoBRET™蛋白的概述:使用高度研究的craft - braf相互作用开发蛋白质相互作用测定。我们证明了在诱导物或抑制剂存在的情况下,标签放置和载体共转染比例优化的重要性。值得注意的是,同样的craft - ht和BRAF-NL融合在HTC116和HEK293细胞中显示出最高的折叠变化。此外,我们以GDC-0879剂量依赖的方式显示了异二聚的刺激。NanoBRET™技术的另一个独特之处在于HaloTag®和NanoLuc®融合具有更广泛的功能,可用于执行修改的HaloTag®下拉试验,然后是NanoLuc®定量验证了craft - braf相互作用,并证明了能量转移观察到的结果表明了两种蛋白质之间的物理相互作用。

文章引用

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如何引用这篇文章

科学文体,2006年第7版

Delaurière, L.和Dubiel, K.开发和测试NanoBRET™craft - braf相互作用分析。【互联网】2019年2月;tpub_203。[引:年、月、日]。可从:https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/2019/tpub-203-detection-of-craf-braf-interaction-in-hct116-cells-using-nanobret/

美国医学协会,《文体手册》,2007年第十版

Delaurière, L.和Dubiel, K.开发和测试NanoBRET™craft - braf相互作用分析。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/2019/tpub-203-detection-of-craf-braf-interaction-in-hct116-cells-using-nanobret/ 2019年2月更新;tpub_203。访问月、日、年。