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发光下拉法确认NanoBRET™蛋白质相互作用测定gydF4y2Ba

莱塔·斯蒂芬和杰基Méndez-JohnsongydF4y2Ba
Promega公司gydF4y2Ba
出版时间:gydF4y2Ba2019年2月;tpub_206gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

生物发光共振能量转移(BRET),能量从生物发光供体融合蛋白转移到物理上紧密的荧光受体融合蛋白,为检测活细胞中的蛋白质相互作用(PPI)提供了一种定量方法。虽然这种技术对于理解活细胞中的PPI和实时PPI动态是有价值的,但确认两种蛋白质直接相互作用的二次检测对确认能量转移结果是有用的。共脲化下拉分析可以满足这一需求。NanoBRET™系统使用NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶作为能量供体和HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba用NanoBRET™HaloTag标记的蛋白质gydF4y2Ba®gydF4y2Ba618荧光团作为能量受体,为能量传递实验提供了一个优化的体系。这些同样的标签也兼容流线型,生物发光下拉方法。在这里,我们演示了完整的工作流程,以及额外的检测控制和优化建议。gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)对许多细胞功能至关重要,是人类疾病的药物靶点。我们开发了NanoBRET™技术,利用HaloTag改进活细胞中蛋白质相互作用动力学的研究gydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白质和NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶作为蛋白质融合标记。gydF4y2Ba(1)gydF4y2Ba(2)gydF4y2BaNanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶是一种小型(19kDa)发光报告物,被设计用于产生明亮、稳定的发光型信号。HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白质是一种细菌衍生的卤代烷烃脱卤酶,它可以通过氯代烷烃连接子不可逆地连接到荧光团。在NanoBRET™PPI试验中,NanoLuc和HaloTag与感兴趣的两个靶蛋白融合并导入细胞。HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白质用荧光光晕标记gydF4y2Ba®gydF4y2BaNanoBRET™618配体,已被优化为NanoBRET™能量受体。当两个靶蛋白靠近时,能量就会从NanoLuc转移gydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶供体的HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2BaNanoBRET™618配体受体。通过受体发射值除以供体发射值计算NanoBRET™比率,提供了两个目标蛋白之间相互作用的定量度量。NanoLuc发出的明亮的蓝移信号gydF4y2Ba®gydF4y2Ba供体与远红移光环标签结合gydF4y2Ba®gydF4y2Ba受体创建一个具有最佳光谱重叠的分析,以及与传统的BRET分析相比增加的信号和较低的背景。gydF4y2Ba

在开发NanoBRET™PPI检测时,确认能量转移结果的第二种方法表明两个靶蛋白之间的直接物理相互作用在解释结果中是有价值的。共脲化下拉试验是确定是否发生直接相互作用的一种方法gydF4y2Ba®gydF4y2Ba和HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合非常适合这种方法。通过交换配体,HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白质可以以多种方式使用,包括在下拉试验中作为诱饵上的标签。NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶提供了一个高度可量化的标签,当与猎物蛋白质融合时,很容易测量。在下拉实验中,光晕标签gydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合蛋白通过氯烷烃基团的共价键与HaloLink™树脂结合,使诱饵蛋白的捕获更加高效和敏感。gydF4y2Ba(3)gydF4y2Ba(4)gydF4y2Ba诱饵蛋白和任何共羧化蛋白复合物可以用ProTEV Plus蛋白酶洗脱来裂解卤代标签gydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合蛋白的标记。共脲化NanoLuc的量gydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合蛋白可以很容易地通过测定荧光素酶活性来检测。不需要额外的克隆步骤或抗体。gydF4y2Ba

在这里,我们描述了一个使用NanoLuc进行共脲化下拉的详细协议gydF4y2Ba®gydF4y2Ba和HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合构建了两个特征良好的PPI检测实例,p53:小鼠双分分钟2 (MDM2)和含溴域蛋白4 (BRD4):组蛋白H3.3 (H3.3)。我们还提供了分析优化和控制的建议。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

材料:gydF4y2Ba

  • 培养细胞(如HEK293)gydF4y2Ba
  • 细胞培养基和试剂gydF4y2Ba
  • 1 x PBS,无菌gydF4y2Ba
  • Nuclease-Free水(gydF4y2Ba猫。# P1195gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • 转染试剂(如FuGENEgydF4y2Ba®gydF4y2Ba高清转染试剂,gydF4y2Ba猫。# E2311gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • OptiMEMgydF4y2Ba®gydF4y2Ba我减少血清培养基(Gibco, Cat。# 31985 - 062)gydF4y2Ba
  • NanoBRET™PPI控制对(p53, MDM2;gydF4y2Ba猫。# N1641gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • NanoBRET™BRD4/组蛋白H3.3相互作用测定(gydF4y2Ba猫。# N1830gydF4y2Ba)或其他优化的NanoBRET™检测方法gydF4y2Ba
  • HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制向量(gydF4y2Ba猫。# G6591gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物下拉系统(gydF4y2Ba猫。# G6504gydF4y2Ba)或HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物下拉及标签系统(gydF4y2Ba猫。# G6500gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • IGEPALgydF4y2Ba®gydF4y2Baca - 630 (Sigma-Aldrich猫。# I3021)gydF4y2Ba
  • ProTEV + (gydF4y2Ba猫。# V6101gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • Nano-GlogydF4y2Ba®gydF4y2Ba萤光素酶测定系统(gydF4y2Ba猫。# N1110gydF4y2Ba)gydF4y2Ba
  • NanoBRET™Nano-GlogydF4y2Ba®gydF4y2Ba检测系统(gydF4y2Ba猫。# n1661, n1662, n1663gydF4y2Ba)包括NanoBRET™Nano-GlogydF4y2Ba®gydF4y2Ba衬底和HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2BaNanoBRET™618配体gydF4y2Ba

设备gydF4y2Ba

  • 发光阅读器[如GloMax]gydF4y2Ba®gydF4y2Ba发现系统(gydF4y2Ba猫。# GM3000gydF4y2Ba)]gydF4y2Ba
  • 冷冻离心机用于球团细胞培养gydF4y2Ba
  • 2ml Dounce均质器与紧杵或25 - 27号针gydF4y2Ba
  • 微型离心机(最好冷藏)gydF4y2Ba
  • 管旋转gydF4y2Ba

蛋白质:在与p53-HaloTag共转染的HEK293细胞中,首次使用优化的NanoBRET™检测蛋白质相互作用gydF4y2Ba®gydF4y2Ba/ NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba-MDM2融合载体或Histone H3.3-HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba/ NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba-BRD4 FL融合向量描述gydF4y2BaNanoBRET™BRD4/Histone H3.3相互作用分析技术手册gydF4y2Ba# TM444gydF4y2Ba.为了在下拉试验中确认蛋白质:蛋白质相互作用(图1),HEK293细胞被镀于1.44 x 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/6cm培养板在MEM + 10%胎牛血清+ 1X青霉素/链霉素(n = 3 /试验对),在37°C和5% CO培养过夜gydF4y2Ba2gydF4y2Ba.然后用FuGENE用表1所示的融合质粒和试剂量转染细胞gydF4y2Ba®gydF4y2BaHD转染试剂(如gydF4y2BaFuGENEgydF4y2Ba®gydF4y2BaHD转染试剂技术手册gydF4y2Ba# TM328gydF4y2Ba)。除了测试对,HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制矢量代替了光晕标签gydF4y2Ba®gydF4y2Ba每个NanoLuc的融合向量gydF4y2Ba®gydF4y2BaPair作为特异性控件。转染细胞在收集前再孵育24小时。gydF4y2Ba

马15340gydF4y2Ba

图1。下拉法流程图。gydF4y2Ba

表1。下拉实验的转染条件。gydF4y2BaHEK293细胞(3.6ml) 4 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/ml被分配到6cm的组织培养板中,在以下每种条件下,每3个重复。细胞培养过夜,然后用指示的试剂和体积转染。另外,之前NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合质粒在无核酸酶水中稀释1:10或1:100,如gydF4y2BaHaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba完成下拉系统技术手册gydF4y2Ba# TM360gydF4y2Ba;最终质量如下所示。使用优化后的HaloTag比例gydF4y2Ba®gydF4y2Ba和NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba根据您的具体化验结果,融合可能有所不同。gydF4y2Ba

HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合质粒gydF4y2Ba HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba质粒(µg)gydF4y2Ba NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合质粒gydF4y2Ba NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba质粒(µg)gydF4y2Ba OptiMEMgydF4y2Ba®gydF4y2BaI减容血清培养基(l)gydF4y2Ba
FuGENEgydF4y2Ba®gydF4y2Ba高清试剂(µl)gydF4y2Ba
p53gydF4y2Ba 7.2gydF4y2Ba MDM2gydF4y2Ba 0.72gydF4y2Ba 200gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba
HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制gydF4y2Ba 7.2gydF4y2Ba MDM2gydF4y2Ba 0.72gydF4y2Ba 200gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba
组蛋白H3.3gydF4y2Ba 7.2gydF4y2Ba BRD4 FLgydF4y2Ba 0.072gydF4y2Ba 200gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba
HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制gydF4y2Ba 7.2gydF4y2Ba BRD4 FLgydF4y2Ba 0.072gydF4y2Ba 200gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba

细胞收集,蛋白质捕获和洗涤按照描述进行gydF4y2BaHaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物下拉和标记系统技术手册gydF4y2Ba# TM342gydF4y2Ba,缩小规模。简单地说,将细胞洗净,收集在4ml冰冷的PBS中,制成颗粒,在-80°C下冷冻至少30分钟。然后将球解冻,用300µl的哺乳动物裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1X终浓度)在冰上处理5分钟,并均质。裂解物经离心(14000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba, 5分钟,4°C), 300µl的清除裂解液用700µl的1X TBS稀释。稀释的裂解液被绑定到200 μ l预平衡树脂在室温下搅拌15分钟管旋转器。树脂离心,用1ml树脂平衡/洗涤缓冲液在室温下洗涤4次。gydF4y2Ba

蛋白质复合物在室温下洗脱1小时,用30U(6µl)的ProTEV Plus蛋白酶在50µl的1X ProTEV Buffer中混合。试管离心(2分钟,800 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba),将树脂制成颗粒,50µl的上清液移至白色96孔检测板上,同时取三孔1X ProTEV Buffer进行背景测量。的Nano-GlogydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶测定系统用于测定捕获的猎物- nanoluc的相对数量gydF4y2Ba®gydF4y2Ba加入100µl的重组纳米glo进行融合gydF4y2Ba®gydF4y2Ba每孔试剂。摇30秒,室温下孵育3分钟,在GloMax上测量发光gydF4y2Ba®gydF4y2Ba发现光度计。背景对照的相对光单位(RLU)比样品低3个数量级,因此不减背景。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

NanoBRET™蛋白质:蛋白质相互作用测定gydF4y2Ba

为了完成这项研究,我们使用了两个特征良好的蛋白质相互作用:p53:MDM2和组蛋白H3.3:BRD4。这两种相互作用都是组成性的,因此不需要复合治疗来诱导其中任何一种相互作用。gydF4y2Ba

转录因子p53作为一种肿瘤抑制因子,对DNA损伤和其他细胞应激反应,启动细胞周期检查点、凋亡或两者兼有。在正常情况下,泛素连接酶MDM2使p53水平保持在较低水平。在HEK293细胞中使用NanoBRET™检测方法检测p53:MDM2相互作用。与无配体对照相比,我们获得了4.7倍的NanoBRET™信号增强(图2)。用10 μ M nutlin-3 (p53:MDM2相互作用的已知抑制剂)处理过夜可以防止这种增强。另一个使用未融合的HaloTag的控件gydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白(HT ctrl)代替p53-HT进一步证实了特异性。gydF4y2Ba

组蛋白H3.3是一种核小体蛋白,通常与转录活性DNA相关,也可能是某些异染色质结构的稳定性所必需的。BRD4是一种组蛋白乙酰转移酶,参与染色质结构的转录调节和表观遗传记忆,已知与组蛋白H3.3相互作用。NanoBRET™检测用于测量HEK293细胞中BRD4和H3.3的相互作用,结果显示,与组蛋白H3.3和BRD4之间的无配体对照相比,NanoBRET™特异性信号增加4.6倍(图2)。gydF4y2Ba

马15341gydF4y2Ba

图2。NanoBRET™PPI在HEK293细胞中与p53:MDM2和组蛋白H3.3:BRD4全长蛋白对的反应。gydF4y2Ba根据技术手册对每个蛋白对进行NanoBRET™PPI分析。gydF4y2Ba面板。gydF4y2Ba在无处理、10 μ M Nutlin -3 (Nutlin)或未融合的HaloTag存在的情况下研究p53:MDM2的相互作用gydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白质(HT ctrl)。gydF4y2Ba面板B。gydF4y2Ba组蛋白H2.3:BRD4相互作用的NanoBRET™比率。HT = HaloTag;问= NanoLuc。取平均值±标准差(n = 4)。gydF4y2Ba

HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba下拉试验gydF4y2Ba

为了确认每个NanoBRET™试验检测到的相互作用,使用HaloTag进行下拉分析gydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物的下拉系统。对每个蛋白质对进行初始下拉试验,以确定适当的细胞培养规模(数据未显示)。两种蛋白质对测试产生的信号都在仪器的线性范围内,输入来自6cm板;其他类型的细胞和蛋白质对可能需要更高的输入(高达15cm的平板)来产生足够的信号。关于扩展转染协议的建议见表2。gydF4y2Ba

表2。光晕标记用细胞培养和转染试剂gydF4y2Ba®gydF4y2Ba下拉试验。gydF4y2Ba稀释细胞至4 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/毫升在适当的培养基中,并板的指示体积所需的测定规模如下。孵育过夜,按照适当的转染方案转染,使用以下指定的试剂量。NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba-猎物DNA应在无核酸酶水中稀释到适合NanoBRET™检测的最佳比例。例如,NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba-MDM2融合载体稀释1:10,7.2 μ l (0.72 μ g)用于6cm板。gydF4y2Ba

板的大小gydF4y2Ba 细胞(毫升)gydF4y2Ba
HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba诱饵DNA(µg)gydF4y2Ba
稀释NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba猎物DNA(µl)gydF4y2Ba OptiMEMgydF4y2Ba®gydF4y2BaI减容血清培养基(l)gydF4y2Ba
FuGENEgydF4y2Ba®gydF4y2Ba高清试剂(µl)gydF4y2Ba
6厘米gydF4y2Ba 3.6gydF4y2Ba 7.2gydF4y2Ba 7.2gydF4y2Ba 200gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba
10厘米gydF4y2Ba 10.0gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba 600gydF4y2Ba 60gydF4y2Ba
15厘米gydF4y2Ba 30.0gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba 30.gydF4y2Ba 1000gydF4y2Ba 90gydF4y2Ba

蛋白对转染HEK293细胞6cm培养,并与HaloTag转染进行比较gydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制向量/ NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合向量评估特异性。按上述方法制备细胞裂解液。使用HaloTag在HaloLink™树脂上捕获蛋白质复合物gydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物的下拉系统。结合蛋白用ProTEV蛋白酶洗脱,再用共脲化的NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba用Nano-Glo测量熔合gydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶检测系统。gydF4y2Ba

下拉的MDM2-NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合与p53-HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba与HaloTag相比,诱饵的发光能力提高了66倍gydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制矢量(图3)。BRD4-NanoLuc的下拉gydF4y2Ba®gydF4y2Ba与组蛋白H3.3-HaloTag融合gydF4y2Ba®gydF4y2Ba与对照组相比,诱饵的发光增加了5倍(图3)。这些数据证实了NanoBRET™的能量转移结果,并支持蛋白质对之间存在直接相互作用的结论。从冷冻细胞颗粒,裂解,捕获到树脂,洗脱和检测可以在不到4小时内轻松完成。gydF4y2Ba

马15342gydF4y2Ba

图3。HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2BaHEK293细胞共表达捕食者- nanoluc的下拉gydF4y2Ba®gydF4y2Ba或者是HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba-诱饵融合或HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制。gydF4y2BaHEK293细胞被镀在6cm的平板上,用标记的HaloTag转染gydF4y2Ba®gydF4y2Ba/ NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba质粒对或HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba控制/ NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba质粒对(“HT对照”),并在~24小时后收集。使用HaloLink™树脂进行下拉分析,并使用50 μ l的ProTEV Plus蛋白酶洗脱配合物。的NanoGlogydF4y2Ba®gydF4y2Ba采用荧光素酶法测定NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba下拉洗脱液中的融合蛋白。gydF4y2Ba面板。gydF4y2Ba通过p53-HaloTag下拉MDM2-NanoLuc。gydF4y2Ba面板B。gydF4y2BaBRD4-NanoLuc通过组蛋白H3.3-HaloTag下拉。取平均值±标准差(n = 3)。gydF4y2Ba

下拉试验优化gydF4y2Ba

根据所研究的蛋白质相互作用,可能需要优化下拉条件。中提供了故障排除gydF4y2BaHaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物下拉和标记系统技术手册gydF4y2Ba# TM342gydF4y2Ba帮助指导分析优化。gydF4y2Ba

可通过添加适当的化合物进行诱导PPIs的下拉分析。我们建议优化以确定适当的处理条件,并确定是否需要测试化合物在整个下拉试验中保持结合。根据作用机制的不同,您可能需要在裂解和清洗缓冲液中添加测试化合物。gydF4y2Ba

对于dna结合蛋白,用RQ1 RNase-Free DNase (gydF4y2Ba猫。# M6101gydF4y2Ba)可能需要消除DNA结合介导的假阳性结果。RQ1 RNase-Free DNase可选治疗描述在gydF4y2BaHaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物下拉和标记系统技术手册gydF4y2Ba# TM342gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

相互作用蛋白的表达水平、相互作用强度、下拉条件和荧光板阅读器的灵敏度可能会影响测定的灵敏度。一些敏感性问题可以通过增加所用细胞培养的规模来克服。表2包含了扩大下拉试验的建议。gydF4y2Ba

下拉试验控制gydF4y2Ba

这里的数据不考虑转染和表达效率的差异,或与HaloLink™树脂的结合效率,可用于进一步规范化下拉数据的考虑因素。控制NanoLuc转染和表达的差异gydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合后,将稀释后的裂解物5µl置于冰上。该预结合对照可用45 μ l的1X ProTEV Buffer稀释,用于测定总NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合蛋白的表达相对于洗脱物使用纳米glogydF4y2Ba®gydF4y2Ba荧光素酶检测。发光代表总输入的1/200。gydF4y2Ba

目的:测定HaloTag的相对转染率和表达效率gydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合,保留额外10µl的稀释预结合裂解物在冰上。HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba熔合伙伴也会影响共价捕获在HaloLink™树脂上的效率。为了控制捕获效率,保留10 μ l的第一次流动在冰上。的HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba融合可以通过凝胶内荧光分析在预结合裂解液和流动控制中测量。简而言之,HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba熔合可以用HaloTag进行共价标记gydF4y2Ba®gydF4y2Ba咯配体(gydF4y2Ba猫。# G8251gydF4y2Ba)或HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba直接TMR配体(gydF4y2Ba猫。# G2991gydF4y2Ba或包含在gydF4y2Ba猫。# G6500gydF4y2Ba),电泳在SDS-PAGE凝胶上,并使用荧光检测扫描仪(例如,Typhoon™FLA 7000扫描仪,GE)在凝胶中定量gydF4y2Ba®gydF4y2Ba医疗生命科学)。看到gydF4y2BaHaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba哺乳动物下拉和标记系统技术手册gydF4y2Ba# TM342gydF4y2Ba一个完整的协议。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

NanoLuc的性能gydF4y2Ba®gydF4y2Ba和HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba蛋白质使它们成为监测活细胞中基于能量转移的蛋白质相互作用动态的有价值的融合伙伴。这些标签也非常适合进行下拉分析,可作为确认能量转移分析中获得的蛋白质相互作用结果的次要方法。通过改变光环标签gydF4y2Ba®gydF4y2Ba配体,你可以使用一个简单的纯化方法和量化的相对量共脲化NanoLucgydF4y2Ba®gydF4y2Ba-标记蛋白。这提供了一种精简的方法,可以在不到4小时内完成,没有额外的克隆步骤或抗体要求。gydF4y2Ba

文章引用gydF4y2Ba

  1. Machleidt, T。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2015)gydF4y2Ba纳米BRET -一种用于分析蛋白质相互作用的新型BRET平台。gydF4y2BaACS化学。医学杂志。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba, 1797 - 804。gydF4y2Ba
  2. Perez-Perri,系统gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2016)gydF4y2BaTIP60复合物是HIF1A的保守共激活物。gydF4y2Ba细胞的代表。gydF4y2Ba16 (1)gydF4y2Ba, 37-47。gydF4y2Ba
  3. 钩,b (2014)gydF4y2Ba清洁蛋白质与HaloTaggydF4y2Ba®gydF4y2Ba纯化树脂gydF4y2BaPromega公司。gydF4y2Ba
  4. 丹尼尔斯,D.L.gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba(2014)gydF4y2Ba利用HaloTag技术发现蛋白质相互作用并表征蛋白质功能。gydF4y2Baj .粘度实验。gydF4y2Ba89gydF4y2Ba, 51553年。gydF4y2Ba

如何引用这篇文章gydF4y2Ba

科学文体,2006年第7版gydF4y2Ba

Steffen, L.和Méndez-Johnson, J. tpub_206用于确认NanoBRET PPI的发光下拉。2019年2月(互联网);tpub_206。[引用:年,月,日]。可以从https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/2019/tpub - 206 -发光-拉- - -确认- nanobret ppi/gydF4y2Ba

美国医学协会,风格手册,第10版,2007年gydF4y2Ba

Steffen, L.和Méndez-Johnson, J. tpub_206用于确认NanoBRET PPI的发光下拉。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/2019/tpub-206-luminescent-pull-down-for-confirming-nanobret-ppi/ 2019年2月更新;tpub_206。访问月日,年。gydF4y2Ba