验证基于细胞的分析方法用于3D模型

分析概述

的CellTiter-Glo®细胞活力测定通过量化活细胞中ATP的含量来检测活细胞。试剂迅速溶解细胞，稳定存在的ATP，并产生与存在的ATP量成比例的发光信号。信号与样本中活细胞的数量成正比。

挑战

与单层培养的细胞相比，含有额外细胞外基质蛋白的3D结构更大。CellTiter-Glo试剂是否完全溶解3D结构并测量3D结构中存在的所有ATP ?

3D模型的适配

1. 新配方试剂。Promega的科学家对试剂配方进行了调整，增加了试剂的溶解能力，从而产生了一种新的CellTiter-Glo®3 d现在可供研究人员专门与3D模型一起使用。在试剂中增加清洗剂，确保它可以溶解高达500μM的三维结构。与原生萤光素酶相比，试剂中的Ultra-Glo™萤光素酶高度稳定，可以承受增加的洗涤剂配方，而不会对活性或稳定性产生显著影响。
2. 协议更新。与原来的CellTiter-Glo®检测相比，CellTiter-Glo®3D的新协议包括了增加的震动时间。这种增加的震动时间有助于物理上破坏3D结构。

验证

研发人员广泛验证了重新配制试剂的性能，以及使用多个3D模型和正交技术测量细胞数量和ATP恢复的优化方案。我们测试了用悬滴法形成的HCT116结肠癌球体和其他细胞类型，包括HEK293胚胎肾细胞和HepG2肝癌细胞。用正交实验方法测定加入试剂后的细胞死亡和用酸提取ATP。

在添加CellTiter-Glo®3D(细胞生物学研究人员的好习惯)后，研发人员首先在显微镜下观察3D结构。从图像上看，即使在添加试剂和额外的震动之后，3D结构仍然存在。这可能会让习惯于观察裂解单分子层细胞的科学家感到惊讶。然而，看似完整的结构仅仅意味着存在于细胞周围的细胞外基质没有被裂解试剂破坏——并不是说细胞裂解无效。因此，验证细胞裂解必须用一种技术来完成，而不是简单的目测结构。

一种试剂，有助于从视觉上和定量上验证细胞裂解是荧光DNA结合染料用于CellTox™绿色的细胞毒性试验。这种试剂不能穿透细胞膜完好的细胞(活细胞)，当它进入细胞膜受损的死亡细胞时，它会与DNA结合并发出荧光。死亡细胞的荧光信号可以用荧光显微镜观察或用平板阅读器定量。研发科学家使用这两种应用表明添加CellTiter-Glo®3D试剂确实可以溶解细胞。在下面的图3中，来自大部分球体的绿色荧光信号直观地证实了样品中新的全层细胞裂解。实际上，体积计算表明~97%的三维球体模型裂解。

该正交测量进一步用于验证来自CellTiter-Glo®3D试剂的信号与球体尺寸之间的一致性关系。第4天ATP水平(CellTiter-Glo®3D信号)和第0天种子细胞数量之间的关系不是线性的(图4，面板A)。这是由于几个因素，包括随着球体尺寸的增大，细胞生长的接触抑制增加，来自营养和氧梯度的影响，甚至是大球体核心的坏死(死亡)细胞。然而，DNA结合染料再次证明了两种细胞数量测量之间的线性关系:1)用CellTiter-Glo®3D检测活细胞的发光，2)合成的溶解细胞的荧光(CellTox™Green)。

这里概述的分析只是一个快照的所有正交测量和验证研究，进入开发CellTiter-Glo®3D。有关这里介绍的实验的更多细节，请参见CellTiter-Glo®3D的介绍．

分析概述

报告基因分析将报告基因引入细胞，并在基因被细胞转录和翻译时检测报告基因的产物。报告可以包括蛋白质标签或酶，如荧光素酶。在本例中，LC3蛋白被广泛用作自噬活性的标记，它被标记为HiBiT，一个小的11a.a。肽标记。细胞表达自噬LC3 HiBiT报告用自噬诱导剂或抑制剂治疗。在实验结束时，细胞被裂解，总LC3通过加入NanoGlo®HiBiT裂解检测试剂其中包括补充的LgBiT蛋白和NanoLuc®底物。

挑战

将自噬LC3 HiBiT报告蛋白导入HEK293细胞，在单层和三维球形细胞中培养报告细胞。LC3 HiBiT报告信号能否准确反映三维球体中的报告水平?

3D模型的自适应

在本试验中，为了检测和量化标记蛋白，细胞必须完全裂解以从所有细胞中恢复标记蛋白。为了方便三维球体的裂解，在加入裂解剂后增加了振荡时间和试剂处理时间。单分子膜的2分钟摇动+ 10分钟培养增加到30分钟球形摇动和培养。

验证

自噬LC3 HiBiT报告物测定系统在三维模型中的性能通过比较报告物与球体模型中ATP含量的回收率来验证，其中ATP是细胞数量的有用替代物。通过在康宁®超低附着96孔板中播种增加细胞数量，从HEK293报告细胞中生成不同大小的球体。培养4天后，生成各种大小的球形体，用于后续使用NanoGlo®HiBiT裂解检测试剂检测自噬报告蛋白水平。在平行平板中，用CellTiter-Glo®3D处理一组类似的球体，以确定ATP含量。

为了确定报告因子和ATP水平之间的关系，两种检测方法的信号相互对照(图5)。两种检测方法之间的关系是线性的，这意味着ATP水平的增加(即第4天细胞数量的增加)与可检测到的自噬报告因子水平成比例的增加相关。这些结果验证了Nano-Glo®HiBiT裂解检测试剂在延长振荡时间的情况下对自噬LC3 HiBiT报告细胞球体的定量恢复和报告检测。

一旦增加震动时间的自噬报告实验被证实在三维细胞球体中有效执行，该检测系统就可以可靠地用于评估处理过的细胞球体中的自噬活性。在3D模型中生长的细胞与在单层细胞中生长的细胞相比，对自噬抑制剂或刺激物的反应会不同吗?在图6中，在HEK293自噬LC3 HiBiT报告细胞中测试的三种特定化合物在单层和球形培养模型中表现相似。自噬刺激剂在两种细胞模型中产生了类似的自噬报告因子降解，而自噬抑制剂在单层和球形格式中都阻止了报告因子降解。也许最显著的区别是与单层细胞相比，球形细胞中巴菲霉素A1的效力明显下降。

这两个案例展示了适应3D模型使用的两种方法。随着3D模型使用的增加和对针对3D模型的测定方法的高需求，将会有更多的测定方法专门设计以满足3D细胞培养的需要。如果无法做到这一点，就应该修改现有的检测方案，并将结果与与多个3D模型进行广泛验证的检测方法进行比较。