甘油三酯代谢的均相分析研究
金伯利·豪普特和迈克·瓦利
tpub_221, 2020年12月
摘要
测量甘油三酯及其代谢对理解代谢性疾病的机制很重要。测量脂质代谢的传统方法——如染色法、比色法或荧光法、质谱法——都是有用的，但每种方法都有其局限性。在此，我们介绍了两种基于敏感生物发光检测的新方法:Triglyceride-Glo™试验而且Glycerol-Glo™试验．这些分析不需要有机提取样品制备，不涉及任何洗涤步骤，大大简化了您的工作流程，同时提供可靠的定量数据。
简介
哺乳动物利用脂类(主要是甘油三酯)来长期储存能量。甘油三酯的合成是为了在饭后储存多余的能量，在禁食期间被分解为身体所有细胞提供能量。甘油三酯的合成(脂肪生成)和分解(脂肪分解)受到激素介导的信号级联的严格调控。
图1所示。脂肪生成和脂解作用。甘油三酯分子是由三个能量密集的脂肪酸酯化成一个甘油分子而组成的。甘油三酯的合成称为脂肪生成，而甘油三酯的分解称为脂肪分解。
甘油三酯代谢失调可在许多疾病中观察到，包括糖尿病、肥胖、肝病(如肝脂肪变性、NAFLD、NASH)和癌症。为了更好地了解和开发这些疾病和其他疾病的治疗方法，研究人员需要工具来监测生物样本中的甘油三酯代谢。脂肪生成是通过检测甘油三酯水平的变化来测量的，而脂肪分解通常是通过检测甘油水平的变化来测量的。
检测甘油三酯代谢的常规方法
在生物样品中检测甘油三酯和测量其代谢有几种常见的方法:
染色
各种廉价的染色剂可用于评估组织或细胞培养样品中的脂质水平(例如，油红O, BODIPY®染料)。染色可以通过显微镜观察，并可以推断脂肪分解或脂肪生成的进展。然而，染色协议很长，有多个洗涤步骤，不适合高通量应用程序。此外，用这种方法无法区分甘油三酯和其他中性脂类。
比色法和荧光板法
这些基于微板的检测试剂盒使用鸡尾酒酶将甘油三酯或甘油转化为可检测的比色或荧光信号。这些分析方法可用于定量代谢，并与各种各样的样品类型兼容。然而，它们的线性范围有限，可能不够敏感，无法检测出与生理相关的脂质水平变化。此外，样品制备可能需要有机提取，在极端温度条件下使用有毒溶剂，需要离心。
质谱分析
光谱测定方法可以用来给出“脂质组”的完整图像——生物样品中存在的所有脂质种类。这些实验产生了大量的定量数据集，可用于描述脂质代谢过程。然而，质谱分析是昂贵的，需要专门的仪器和技术专长。如此庞大、无目标的数据集分析起来非常耗时，而且可能超出了您的需求范围。
生物荧光法监测甘油三酯代谢
我们已经开发了新的分析方法，提供了一种更简单的方法来调查和监测甘油三酯代谢:Triglyceride-Glo™试验而且Glycerol-Glo™试验．这些添加和读取测定方法与各种各样的样品类型兼容，包括溶解细胞、培养基、组织匀浆、血清和脂蛋白组分。它们的发光读数比比色法或荧光板法更灵敏，并能对代谢变化进行可靠和准确的定量。
这两种分析方法的核心都是甘油分子和光产生的相关性。仅对于甘油三酯- glo™检测，需要进行初始脂肪酶处理将甘油三酯转化为甘油。然后，在两种试验中，一对酶(甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶)氧化甘油生成NADH。接下来，还原酶利用NADH将其促荧光素底物转化为荧光素。最后，Ultra-Glo™荧光素酶氧化荧光素产生可见光。产生的光量可以用光度计测量，并与起始样品中甘油三酯/甘油的数量相关。Ultra-Glo™r萤光素酶经过工程设计，无论使用清洁剂、还原剂或温度波动，都能发出明亮、持续的光，因此对任何样品类型的检测输出都是稳健的。
图2。甘油三酯- glo™和甘油- glo™检测方法示意图。脂肪酶步骤仅发生在甘油三酯- glo™检测中。
甘油三酯- glo™和甘油三酯- glo™测定有一个简单的协议:只需向样品中添加试剂，孵卵，并使用任何读板光度计读取板(图3)。制备样品不需要有机提取、极端温度或高速离心。相反，分析使用一个简单的30分钟的洗涤剂裂解步骤。对于细胞培养实验，检测试剂可以直接添加到含有细胞的孔中，也可以添加到单独的培养皿中的培养基样品中。后一种方法使细胞可用于附加的下游分析，如测量其他代谢物或细胞活力。此外，甘油三酯- glo™和甘油- glo™测定法可用于384孔板的高通量筛选应用。
图3。甘油三酯- glo™和甘油- glo™检测简单，同质的工作流程。
| 脂质代谢检测方法 | 优势 | 缺点 |
|---|---|---|
| 染色 |
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| 比色/荧光化验 |
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| 质谱分析 |
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| Promega发光分析 |
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我们的生物荧光脂质代谢测定结果可以证实和补充其他方法，特别是定性读出的方法。图4显示了如何使用甘油三酯- glo™检测和油红O染色并行监测脂肪细胞分化和脂肪生成。
图4。脂肪细胞分化过程中的脂质积累。在平行96孔板中，我们监测3T3L1-MBX细胞从成纤维细胞(图A，第5天)到分化阶段1(图B，第12天)和2(图C，第14天)到成熟脂肪细胞(图D，第21天)的脂质积累。一组培养皿用油红O染色(A-D)，另一组根据甘油三酯- glo™分析规程(E)进行分析。在分化的每个阶段，去除培养基、清洗细胞和脂肪酶处理后，将处理样品的2.5µl等分稀释成47.5µl的甘油裂解液，按标准规程进行分析。数据为6次重复的平均值，甘油三酯通过测定总甘油水平测定。
监测糖尿病研究中的胰岛素活性
胰岛素是脂质代谢的重要调节剂。在肝细胞和脂肪细胞中，它促进脂肪生成和抑制脂肪分解。使用甘油三酯- glo™和甘油- glo™分析，您可以监测胰岛素和其他效应器对脂质代谢的影响。在图5中，甘油- glo™检测被用于监测脂肪细胞中的脂肪分解。用异丙肾上腺素治疗使脂肪分解增加到基础水平以上。同时使用异丙肾上腺素和胰岛素治疗也会导致胰岛素升高，但升高幅度小于单独使用异丙肾上腺素。通过这种方式，甘油- glo™检测可用于评估脂分解的激活剂和抑制剂。
图5。胰岛素介导的脂肪细胞甘油释放抑制。3T3-L1 MBX细胞分化的脂肪细胞被异丙肾上腺素(25nM)和胰岛素(150nM)联合处理。处理90分钟后，从每个孔中取出一份培养基样品，使用甘油- glo™测定法进行分析。每种条件都进行了三次重复试验，误差条表示标准偏差。
肝脏疾病研究中的脂肪变性监测
bsa结合的脂肪酸和脂蛋白通过脂肪生成刺激肝细胞内甘油三酯的积累。在这里，我们使用甘油三酯- glo™检测在几种治疗条件下和随时间变化的人类肝脏3D显微组织中监测甘油三酯含量。结果表明，甘油三酯- glo™检测可用于监测细胞模型中脂肪变性的进展。
图6。人肝组织中的甘油三酯水平。3D InSight™人类肝脏微组织(InSphero)在无血清培养基中孵育3天和10天，无血清培养基中含有生理(LG/LI)或生理上(LG/HI)水平的葡萄糖和胰岛素，并补充与BSA (FFA)结合的游离脂肪酸或低密度脂蛋白血浆组分(LDL)。微生物组织在PBS中洗涤两次，并根据甘油三酯- glo™协议测定总甘油含量。数值绘制为每个显微组织(MT)的甘油三酯浓度。数据由瑞士苏黎世InSphero公司慷慨提供。
总结
甘油三酯- glo™和甘油- glo™分析为需要测量脂肪分解和脂肪生成的研究人员提供了一种更好的方法。他们的简单，免洗协议结果比比色法或荧光板为基础的测定更敏感的生物发光检测。该方法不需要繁琐的有机提取，而是使用快速的洗涤剂裂解步骤来制备脂质样品。这些生物发光分析可以独立或补充其他脂质检测方法。
确认:我们非常感谢InSphero的合作者提供了如图6所示的人类肝脏显微组织数据。
