CellTiter-Glo®3D:一种用于3D细胞培养的灵敏、准确的活力测定方法

二维细胞培养长期以来一直是体外实验的宝贵工具。然而，对粘附在塑料上的扁平单层细胞的研究结果往往不能很好地反映体内情况。在复制这些生物功能的3D细胞培养条件下产生的微生物组织，可以更好地代表实际组织的各种特征，如形态学、细胞-细胞通讯、基因表达和生物反应性。大量的工作已经投入到各种可用的3D细胞培养模型的开发中，但很少有人投入到开发有效检测这些模型的试剂上。假设为2D单分子层设计的分析方法同样适用于3D显微组织，这对数据质量有很大的风险，特别是考虑到在显微组织球体中试剂渗透的需求增加。CellTiter-Glo®3D Assay是一种新的单组分液体试剂，用于测量细胞活力。该方法增加了裂解能力，并专门用于通过3D细胞培养产生的微生物组织。

用经典的CellTiter-Glo®分析方法进行的初步研究表明，小组织具有有效的裂解能力。然而，通过与费力的三氯乙酸提取过程的结果进行比较，可以判断，随着显微组织变大，经典试剂少报了ATP的总量。因此，我们优化了CellTiter-Glo®Assay配方，以增加裂解能力，并生成一种新的3d优化的生物发光细胞活力测定方法。如表1所示，经典的CellTiter-Glo®和CellTiter-Glo®3D Assay试剂从小的HCT116结肠癌球体(~200 μ m直径)中回收的ATP量相似，但随着球体变大(> 350 μ m直径)，CellTiter-Glo®3D试剂比经典试剂多回收20-40%的ATP。我们还观察到其他细胞类型的恢复也有类似的增加，包括HEK293胚胎肾细胞和HepG2肝癌细胞(数据未显示)。

与经典的CellTiter-Glo®试剂一样，CellTiter-Glo®3D试剂产生的发光信号与使用纯ATP存在的ATP量成正比(图1，面板a)，而ATP的量与二维细胞培养中存在的细胞数量成正比(图1，面板B)。

然而，对于三维培养的微生物组织，细胞种子与发光信号之间的相关性往往不是线性的。例如，使用InSphero GravityPLUS™3D培养和分析平台(图2，面板A)产生的悬滴球状体，诸如接触抑制细胞增殖和降低大球状体中心区域的代谢活性等影响会导致种子细胞数量和发光信号之间的关系呈曲线(图2，面板B)。然而，通过加入CellTox™绿色染料(一种细胞膜非渗透荧光dna结合染料)，在我们的裂解试验中，我们可以表明，随着显微组织大小的增加，通过CellTiter-Glo®3D试验检测到的ATP的数量(发光，RLU)与检测到的DNA的数量(荧光，RFU;图2,C区)。这证实了CellTiter-Glo®3D Assay可以有效地溶解细胞，导致ATP的释放，并可以准确报告通过3D细胞培养产生的微组织中活细胞的数量。

在测定细胞活力时，CellTiter-Glo®3D试剂明显比竞争的生物发光ATP检测试剂更亮(图3，面板a)。如表2所示，这种差异是由于CellTiter-Glo®3D试剂从小组织和大组织中回收了多得多的ATP。这可能是由于(部分)由于CellTiter-Glo®3D试剂的组成更能保存ATP，但也由于溶解效果的显著差异(图3，图B)。在添加到球体样品之前，将CellTox™绿色染料添加到每个试剂中，对~300 m HCT116球体的共聚焦激光荧光显微镜显示，CellTiter-Glo®3D试剂几乎完全穿透整个球体的厚度。相比之下，竞争试剂只穿透相同尺寸球体的外层三分之一。

与许多生物荧光测定法一样，CellTiter-Glo®3D测定法显示的信号高于本底数量级(图4)。相比之下，其他测量荧光变化(如alamarBlue®)或吸光度(如MTT)的非溶性活力测定法产生的信号仅略高于无细胞对照信号。除了这种增强的灵敏度，CellTiter-Glo®3D检测具有更短的检测时间。发光分析可以在30分钟或更短的时间内测量，而alamarBlue®和MTT分析通常需要数小时的孵育。