一种检测活性氧的发光新方法

Sarah Duellman, John Shultz, Gediminas Vidugiris和James Cali。
Promega公司
出版时间:10/13

摘要

这里我们介绍ROS-Glo™H₂O₂测定法，一种快速灵敏的检测活性氧的发光测定法。这种均质法测定H₂O₂直接在细胞培养或在确定的酶反应中。该方法不使用辣根过氧化物酶，避免了与基于hrp的系统相关的高假命中率，并且不需要对基于细胞的应用进行细胞样本操作。ROS-Glo™H₂O₂分析允许识别条件或测试化合物，如改变ROS水平的小分子抑制剂或诱导剂，易于自动化，并可与其他分析相复用，以从每个分析孔中产生更多信息。

活性氧测定

活性氧(ROS)是含有氧的化学反应分子。ROS对细胞有益，在细胞信号传导中起作用，是正常代谢的天然副产物leyu乐鱼网^(1）．由于环境因素(如辐射)或代谢异常，ROS也可导致细胞损伤或氧化应激^(1）（2）．活性氧是活性的(例如，超氧化物，单线态氧，H₂O₂)并且在溶液中的半衰期很短。酶促和非酶促反应导致ROS转化为过氧化氢(H₂O₂)在细胞里^（3）．例如，超氧化物歧化酶能迅速将超氧化物转化为H₂O₂．H₂O₂在溶液中具有相对较长的半衰期，并可扩散出细胞，这使其成为氧化应激的良好标记。H₂O₂是酶活性的生物标志物，酶活性消耗或产生H₂O₂．

目前的荧光酶检测格式容易出现错误的命中率，这对于有效的筛选应用来说太高了。目前基于细胞的ROS分析需要大量的细胞和样品操作，不适合高通量的应用。为了研究ROS的生物学和筛选化合物改变H的能力，需要新的测定方法₂O₂培养细胞或酶反应中的水平。ROS-Glo™H₂O₂荧光法是一种检测H₂O₂直接，最大限度地减少错误命中率。重要的是，ROS-Glo™检测不使用辣根过氧化物酶(HRP)，这是已知会导致大量错误的结果。ROS-Glo™分析还为基于细胞和酶的分析提供了简单的格式。

由于各种ROS都转化为H₂O₂在细胞中，H₂O₂是最长寿的ROS, H₂O₂可反映ROS水平的普遍升高。ROS-Glo™检测方法使用H₂O₂与H直接反应的底物₂O₂生产荧光素前体，它不是合适的荧光素酶底物。添加ROS-Glo™检测解决方案将前体转化为荧光素，并提供荧光素酶和其他组件以生成与H水平成比例的光信号₂O₂(图1)。

简单ROS测定格式

ROS-Glo™Assay被设计为一个单一的试剂盒，可用于生物化学和基于细胞的应用(图2)₂O₂底物可与测试化合物一起或在细胞处理后添加到培养细胞的孔中。然后在正常的哺乳动物细胞培养条件下培养细胞。孵育后，加入ROS-Glo™检测液，在读取发光前孵育20分钟。无需除去培养基，可直接在细胞培养板中进行检测。

ROS-Glo™H₂O₂分析也可以在非溶菌的，以细胞为基础的模式下进行。这里是H₂O₂在反应中加入底物，让其与H反应₂O₂．含有H的介质₂O₂然后将底物移到单独的平板上，用ROS-Glo™检测溶液进行孵育。这种分析格式允许原始孔用于另一种分析。以这种方式将ROS-Glo™与其他分析方法进行多路复用，可以从每口井中获得更多信息。

对于酶促反应，H₂O₂如果酶反应在pH值7.5-9下进行，底物可与反应组分一起直接加入酶反应。在这个pH范围内，H₂O₂底物与H反应良好₂O₂．如果酶反应在这个pH值范围外进行，H₂O₂底物可直接稀释成1M Tris-HCl pH 8.0，待酶反应完成后加入。Tris缓冲液是一种很好的H稀释剂₂O₂底物，也使酶反应进入所需的pH值范围，使H₂O₂底物和H₂O₂进步。

酶促反应

ROS-Glo™H₂O₂测定法可用于测定产生或消除H的酶的活性₂O₂．例如，NADH氧化酶是一种利用NADH和氧气产生H的酶₂O₂和NAD +。来自ROS-Glo™检测的发光信号与H₂O₂一旦确定了适当水平的NADH氧化酶和NADH底物，该方法就可以通过寻找发光的减少来确定化学文库中酶的抑制剂。

基于单元的化验

ROS-Glo™H₂O₂测定法可用于测定细胞中产生的活性氧的增加或减少。H₂O₂迅速扩散进出细胞和H₂O₂底物会与H反应₂O₂在每个实验孔中，无论它是在细胞中还是在培养基中首先产生。Menadione是一种阻断线粒体电子传递链的化合物，在培养细胞中产生大量的ROS。在图4中，用menadione和ROS-Glo™H处理K562细胞₂O₂测定ROS的产生。美萘醌治疗导致浓度依赖性ROS增加。

小分子筛选

ROS-Glo™H₂O₂与其他商业上可用的小分子筛选方法相比，该方法具有许多优点，包括低假命中率，信号稳定性和与液体处理程序的兼容性(例如，步骤更少，无需在黑暗中进行检测)。因为H₂O₂底物与H直接反应₂O₂，与其他检测方法(如Amplex®Ultra Red)相比，假命中率显著降低。许多ROS检测需要HRP，通过抑制HRP或与H竞争导致过多的错误命中₂O₂或HRP酶的试剂探针。

在1280种药理活性化合物(LOPAC)库的筛选中，我们比较了ROS-Glo™检测方法与Amplex®Ultra Red hrp检测方法¹²⁸⁰；Sigma-Aldrich)。通过测定每个测定法检测10 μ M H的能力，直接测试测定法的化学成分₂O₂(不涉及酶或细胞)。Amplex®Ultra Red屏幕的命中率为7.1%，而ROS-Glo™Assay的命中率仅为0.5%。HRP与许多化合物反应，这似乎导致H的减少₂O₂，但实际上这些都是虚假的。此外，ROS- glo™检测发现了Amplex®Ultra Red屏幕遗漏的信号诱导剂(图5)。这些化合物是天然的ROS发生器，使H₂O₂但由于HRP抑制，Amplex®Red检测没有检测到H₂O₂生成(图5和表1)。

ROS-Glo™H₂O₂检测还使用HepG2细胞在完全培养基中筛选LOPAC文库(图6)。增加ROS- glo检测信号的化合物是LOPAC文库中在培养的哺乳动物细胞中产生ROS的化合物(真命中)。

复用ROS-Glo™H₂O₂分析

为了从每个检测孔中获得更多的信息，ROS-Glo™检测可以使用技术手册(#TM391)中提供的非溶性检测协议与各种其他分析进行多路复用。H₂O₂底物首先与感兴趣的反应孵育，然后是含有H的介质或缓冲液₂O₂将基板移除，添加到新井的ROS-Glo™检测溶液中。该方案很好地保留了原始的测定方法，以便用不同的测定方法进行进一步分析，例如，用CellTiter-Glo®测定方法进行细胞活力测定。

ROS- glo™检测和CellTox™绿色细胞毒性检测也可以很容易地以多种格式进行，以确定ROS的产生，细胞毒性和总细胞数(用于标准化)。要进行这两种多重分析，H₂O₂基质和CellTox™绿色染料在处理过程中添加到细胞中。首先读取荧光CellTox™绿色信号，然后添加ROS- glo™检测溶液以生成与ROS水平相关的发光信号(图7)。ROS- glo™检测溶液还溶解细胞，因此CellTox™绿色信号的另一个荧光读数将确定细胞总数并允许归一化。

总结

ROS-Glo™H₂O₂测定法测定培养的哺乳动物细胞中活性氧含量的变化。该试验还可用于测量产生或消除H的酶的活性₂O₂．这使得可以更容易地筛选影响酶(如NADH氧化酶)活性的化合物的化学库。ROS-Glo™检测技术不依赖于HRP催化的反应，因此导致低得多的错误命中率。该检测可以在快速“添加-混合-测量”格式的多孔板中轻松进行。该测定方法也可以与其他测定方法重复，允许从每个测定孔中获得更多的数据。

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文章引用

1. 阿尔法达，A.和萨拉姆，R. (2012)活性氧在健康和疾病中的作用j .生物医学。生物技术。8月8日在线发表。doi: 10.1155 / 2012/936486。
2. 维C。等．(2012)过氧化氢在炎症中的作用:信使、向导和杀手。放置内科杂志。6月12日在线发布。doi: 10.1155 / 2012/541471。
3. Newsholme, P。等．(2012)活性氧和氮的生成，抗氧化防御和β细胞功能:氨基酸的关键作用。j . Endocrin。21411日至20日。

如何引用这篇文章

科学文体，2006年第7版

Duellman, S.， Shultz, J.， Vidugiris, G.， and Cali, J.一种用于检测活性氧的新型发光分析方法。(互联网)10/13。[引:年、月、日]。可从:https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/a-luminescent-assay-for-detection-of-reactive-oxygen-species/

美国医学协会，《文体手册》，2007年第十版

Duellman, S.， Shultz, J.， Vidugiris, G.， and Cali, J.一种用于检测活性氧的新型发光分析方法。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/a-luminescent-assay-for-detection-of-reactive-oxygen-species/ 13月10日更新。访问月、日、年。