通过结合CyBi®-Felix液体处理仪器，为化学实验室提供可靠的自动细胞毒性分析
1Promega Corporation，麦迪逊，威斯康星州;2Analytik Jena US, CyBio产品线。
出版时间:2014.12 (tpub_159)
摘要
了解化合物的毒性机制对基础研究和药物开发都很重要。我们开发了一个自动化的工作流程来确定化学介导的细胞毒性机制。细胞毒性模式是通过CellTox™Green Express细胞毒性检测与CellTiter-Glo®2.0或Caspase-Glo®3/7检测显示的。当一起使用这些测定方法时，有助于区分化学作用对细胞健康的常见机制:坏死、凋亡或生长停滞。我们使用CyBi®-FeliX液体处理器和GloMax®Discover Multimode Reader仪器进行了分析实验，这对自动化新手来说是简单的选择。此外，试剂包括冷冻、解冻和使用HepG2细胞，这消除了在培养中生长和维持细胞的负担。我们的自动化方法使细胞毒性分析成为一个更容易和直接的经验，化学重点实验室。
介绍
体外细胞分析是评价化合物毒性的一种方便和经济的方法，特别是在药物发现研究项目中。一个典型的工作流程包括测试化合物的滴定，应用到细胞，并培养几天。我们使用CyBi®-FeliX (Analytik Jena US, CyBio产品线)仪器作为一个独立的全自动系统来执行所有细胞毒性分析特定的液体处理任务。.jpg)
通过应用设计用于测量感兴趣的生物标志物的试剂来量化测试化合物的影响。一般来说，引起细胞毒性作用的化合物或治疗方法是通过引起剧烈的形态变化、对复制率产生不利影响或导致活细胞数量减少来实现的。从体外方法获得的信息是标记潜在毒性责任的重要先决条件。
在机制细胞毒性分析中，独特的生物标记物被用于分析细胞的健康状态。在本报告中，我们使用了一个由三种实验组成的小组来评估与膜完整性(细胞毒性)、细胞数量和凋亡变化相关的生物标志物。当一起使用时，这些生物标志物可以帮助区分坏死、凋亡或生长受阻的细胞群。表1描述了用于这项工作的测定方法。
| 表1。本研究中用于自动细胞毒性分析的Promega细胞健康分析的描述 | |||
| 分析 | 的决心 | 描述 | |
| CellTox™Green Express细胞毒性检测 | 细胞毒性或细胞膜受损 | 由DNA结合染料组成的非溶解试剂，对细胞膜受损的细胞具有渗透性。当染料与DNA结合时，就会变成高度荧光，而荧光信号与样本中死亡细胞的数量成正比。在细胞镀膜时，可以方便地将染料添加到细胞悬液中，从而随着时间的推移监测细胞毒性。非溶试剂可与其他光谱不同的荧光染料或发光测定物复相。TM375 | |
| CellTiter-Glo®2.0检测 | 细胞数量或活力 | 使用荧光萤火虫荧光素酶反应定量细胞群中ATP的溶解试剂。发光信号与ATP含量成正比，表明活细胞的数量。TM403 | |
| Caspase-Glo®3/7检测 |
细胞凋亡 | 定量caspase-3/7活性，细胞凋亡晚期酶活性的裂解发光试验。一个devd -原萤光素底物被caspase-3/7裂解产生游离萤光素，在萤火虫萤光素酶反应中定量。发光信号与caspase-3/7活性成正比，指示细胞发生凋亡。TB323 | |
我们将CellTox™Green Assay与CellTiter-Glo®2.0或Caspase-Glo®3/7 Assay混合使用，以最大限度地减少样品处理并保存细胞样本。CellTiter-Glo®2.0和Caspase-Glo®3/7的检测化学成分不兼容。因此，我们收集重复样本分别评估细胞活力和凋亡。
冷冻，解冻和使用的细胞提供了一个方便的选择，从连续培养的细胞为这个分析工作流程。这种解冻后使用的细胞在解冻后立即制备和镀，消除了任何先前的细胞培养活动。传代数和合流性可以影响培养细胞的生物学性能，而使用解冻使用细胞可以避免这些问题。
通过对所有实验步骤使用实验室自动化，剖析工作流程得到了简化。在这里，我们自动连续滴定和应用测试化合物到一个检测板，以及添加细胞和试剂。结合自动化确保一致的实验设置，消除用户对移液的可变性，提高实验室的效率。在这个应用中，我们使用了Frozen Instant HepG2 Cells(细胞培养服务)，一种人肝细胞系，CyBi®-FeliX仪器用于所有液体处理步骤，GloMax®Discover多模式检测系统(Promega)用于检测荧光和发光检测信号。
采用这种自动化分析过程需要更少的时间和精力投入到实验步骤中。自动化过程能够在384孔微孔板格式中测试多达八种化合物的四重复。复制板可以组装时，需要时间课程研究。
材料与方法
材料
•DMSO (Sigma Aldrich, Cat;# D8418)
•甲氨蝶呤(Sigma Aldrich, Cat;# M9929)， 10mM DMSO
•panobinostat (Selleckchem, Cat.)# S-1030)， 10mM DMSO
•柠檬酸他莫西芬(Sigma Aldrich, T9262)， 10mM DMSO
•nocodazole (Sigma Aldrich, Cat;# M1404)， 10mM DMSO
•bortezomib (LC Laboratories, Cat;# B-1408)， 10mM DMSO
顺铂(Sigma Aldrich, Cat;# P4394)， 10mM DMSO
•staurosporine (EMD Millipore, Cat。#569397)， 10mM DMSO
特非那定(Sigma Aldrich, Cat。# T9652)， 10mM DMSO
CellTiter-Glo®2.0 Assay (Promega, Cat;# G9242)
•CellTox™Green Express细胞毒性检测(Promega, Cat;# G8731)
•Caspase-Glo®3/7 Assay (Promega, Cat;# G8093)
•cellgro DMEM, 1X, 4.5 g/葡萄糖。l -谷氨酰胺&丙酮酸钠(康宁猫)# 10-012-CV)补充10% FBS
•EMEM与l -谷氨酰胺(ATCC Cat。# 30-2003)补充10%胎牛血清和1X青霉素/链霉素
•EMEM与l -谷氨酰胺(ATCC Cat。# 30-2003)补充10% FBS和5% DMSO
•Costar®v底聚苯乙烯96孔检测板(康宁，Cat。# 3896)
•白色384孔检测板(Greiner bio one Cat。# 781080)
•8排分区油藏(Seahorse Bio Cat。# 201282 - 100)
•384 HH, 4X控制，金字塔底储层(海马生物猫。# 201300 - 100)
•96 LP金字塔底油藏(Seahorse Bio Cat)。# 201254 - 100)
•冷冻即时细胞，HepG2(细胞培养服务，ID 89)
CyBi®-FeliX自动液体处理机
CyBi®-FeliX自动液体处理机包含两层12个甲板位置，允许在多孔板、管架和储层之间进行多种试剂的液体转移，占地面积为650mm × 450mm (W× D;图1).我们使用了96通道移液头(250 μ l)和8通道液体处理适配器。当使用预裂解的CyBi®- robotip托盘时，96通道头可以并行处理96孔和384孔多孔板。8通道适配器允许移液到单孔和柱。快速分配消除了细胞在源库中沉淀的担忧，并最大限度地减少了细胞暴露在环境中的时间。移液头执行液体处理适配器的切换和加载移液头，无需人工干预，允许自动检测。
图1。CyBio CyBi®-FeliX移液站。CyBi®-FeliX的两层甲板设计占地面积小，同时为试剂和实验室用品消耗品提供足够的甲板位置。用户可以定制仪器配置，以满足他们的特定需求。
GloMax®Discover多模式检测系统
这款GloMax®Discover系统包括高性能发光、荧光、紫外-可见吸收、BRET、FRET、过滤发光和动力学测量功能(图2)。集成的平板电脑具有直观的软件，快速拖放协议创建。快速读取功能和>40预加载和验证协议促进快速和简单的数据生成。
图2。Promega GloMax®Discover系统GloMax®Discover是一种多模式读取器，可接受从6孔到384孔的多孔板。该仪器由集成的平板电脑操作，其中包含增强的软件和直观的图形界面。快速读取功能和预加载检测协议可以快速生成数据。拖放功能加快了自定义检测协议的创建。
板块布局和储层配置
我们使用96孔v型底板(康宁)进行复合滴定，因为v型孔有助于减少死容积。然后，我们将化合物放入稀释板的第1列和第6列(图3)，并使用8通道适配器向其余列添加介质，并对每列化合物进行连续五点滴定。然后使用96通道适配器将滴定化合物多次分配到384孔检测板。
通过允许CellTiter-Glo®和Caspase -Glo®3/7检测试剂位于同一源位置(图3)，一个八排试剂库有助于节省甲板空间。使用带有CyBi®-RoboTipTray 96/250 μ l的96通道适配器同时将两种溶液转移到检测板上。
图3。平板布局和单元储层配置。上层和下层甲板的布局。注意细胞库的位置和内部布局，包括控制分区、96孔复合稀释板和八排含有CellTiter-Glo®和Caspase-Glo®试剂的试剂库。
板设置
- HepG2细胞解冻后悬浮于EMEM + 10% FBS + 1X青霉素/链霉素中，浓度为250000细胞/ml。将CellTox™Green试剂按1:80稀释添加到培养基中;化验装配后，染料的稀释倍数为1:1000。
- 将测试化合物在EMEM + 10% FBS中稀释至125 ~ 500 μ M的5X浓度。每种稀释化合物100 μ l手动排列到96孔板的柱1和柱6(图3)，并将板放置在CyBi®-FeliX甲板顶部的位置7上。
- 将由EMEM + 5% DMSO + 10% FBS组成的稀释剂倒入96口井的锥形底油藏。
- 将细胞悬浊液倒入384口4X控制金字塔底油藏的主隔板中。在储层控制分区中加入EMEM + 10% FBS + CellTox™Green试剂组成的无细胞对照(见图3)，将储层置于9号位置。
- 两个384孔的检测板放置在仪器甲板的11和12位置，底部甲板装满了一个CyBi®-TipBox 96/250 μ l，一个8通道液体处理适配器和四个CyBi®- robotiptray 96/250 μ l。
- 运行自动化程序，指导CyBi®-FeliX执行以下液体处理操作:将20µl细胞悬浮液和无细胞对照品分配到检测板的每个孔中。化合物在5% DMSO中EMEM + 10% FBS稀释液中进行5点1:10连续滴定。接下来，每种药物滴定5 μ l，一式四次添加到检测板中的细胞中。为了考虑背景信号，分析板的23柱和24柱不含细胞(图4)。
图4。分析板布局显示滴定化合物和对照。使用384孔板，我们复制了相同的化合物，并在A-H行和I-P行分配模式。关键词:A =硼替佐米，B =顺铂，C =甲氨蝶呤，D =诺可达唑，E =帕比诺司他，F = staurosporine, G =特非那定，H =他莫昔芬，I = 1% DMSO载体对照，J =无细胞对照。
试剂添加和信号检测
- 检测板在37°C和5% CO的细胞培养箱中孵育24或48小时2．在每个时间点之后，将检测板冷却到环境温度15分钟，然后在脱机电磁摇床上摇1分钟(Union Scientific)。
- 然后将板放入GloMax®Discover中，使用蓝色滤光片对[470nm(激发)/ 500-550nm(发射)]测量CellTox™绿色染料的荧光变化。
- 8排分区储液库的1-4行各装满5ml CellTiter-Glo®2.0试剂，4-8行各装满5ml Caspase-Glo®3/7试剂(图3)。储液库和检测板放置在CyBi®-FeliX仪器的顶层甲板上
- CyBi®-FeliX同时将25 μ l两种试剂转移到检测板上。
- 摇板2分钟，室温孵育60分钟。
- 孵育后，在GloMax®Discover上测量发光。使用GraphPad Prism®软件绘制细胞毒性(CellTox™Green Express Assay)、细胞活力(CellTiter-Glo®2.0 Assay)和凋亡(Caspase-Glo®3/7 Assay)的结果。
结果
我们使用三种已知的导致细胞死亡的独特和特定机制的有毒化合物评估了三种机械性细胞毒性谱。Panobinostat是一种非选择性组蛋白去乙酰化酶抑制剂，显示出caspase-3/7活性的显著剂量依赖性增加，细胞活力标志物ATP相应降低。在本研究中，我们检测到细胞毒性生物标志物的小幅升高，表明这些凋亡细胞开始发生继发性坏死(图5,a图)。
他莫昔芬是一种雌激素受体拮抗剂，在本研究中提供了细胞在检测时发生继发性坏死的示例结果，这种坏死发生在诱导凋亡后。如图5，面板B所示，在24小时内，最高浓度的他莫西芬测试(100 μ M)产生了细胞毒性特征，包括膜完整性的变化，对细胞活力有深刻的负面影响。然而，一些caspase-3/7生物标志物被检测到。先前的研究表明，这种浓度的他莫西芬确实会在治疗后几小时内诱导细胞凋亡(1)，但由于生物标志物的衰变，检测到的caspase活性量会随着时间的推移而下降。我们低水平的caspase活性检测，结合膜破裂和细胞活力大幅下降，表明凋亡确实发生得更早，24小时时间点在凋亡最大检测窗口之外。
甲氨蝶呤是一种二氢叶酸还原酶抑制剂，最终阻止DNA和RNA的合成。如图5面板C中24小时暴露所示，半胱天冬酶和膜完整性生物标志物保持不变，而细胞活力生物标志物显示出强有力的剂量依赖效应。由于细胞膜生物标志物保持不变，与对照相比，由此导致的信号下降表明了抗增殖作用，而不是细胞毒性作用。
图5。代表性的机制细胞毒性图显示(A图)在治疗后24小时发生凋亡，(B图)坏死，(C图)生长停滞。我们从实验结果中减去培养基对照测定背景，并在测定板上绘制相对于未处理对照的折叠变化数据。
暴露时间是评估机械细胞毒性的关键参数。图6显示了微管聚合抑制剂诺可达唑的效果。治疗24小时后，检测到的任何生物标志物都没有变化，这表明细胞在培养中仍然存活。治疗48小时后观察到生物学上不同的生物标志物。观察到细胞活力呈剂量依赖性下降，caspase-3/7活性和细胞毒性同时增加，表明细胞正在经历凋亡和继发性坏死。因此，将测试工作集中在24小时内可能会得出错误的结论，即测试化合物对细胞健康没有影响，而持续接触则显示出细胞毒性作用。
图6。诺可达唑的时间和剂量依赖效应，一种破坏微管形成的抗有丝分裂剂。我们的数据图上的小误差条显示，在每次化合物滴定中都实现了整体低%CV。在四次重复作业中，%CV通常为5%或更低，这反映了所有添加到井中的液体的精确处理。我们发现8通道适配器执行准确的滴定测试化合物的预期效力支持与我们的模型测试化合物。
总结
我们成功地实现了一种自动区分细胞凋亡、坏死和生长停滞的方法。我们的自动化方法包括使用解冻后使用的HepG2细胞作为我们的生物模型系统，商业生物发光和荧光实验来评估细胞毒性，CyBi®-FeliX用于液体操作，GloMax®Discover用于读数。使用三种生物标志物来评估化学处理是否会引起坏死、凋亡或生长停滞。代表性化合物的特征显示了每种独特毒性机制的预期数据模式:panobinostat用于细胞凋亡，他莫昔芬用于继发性坏死伴部分细胞凋亡，甲氨蝶呤用于生长阻滞。我们还证明了化合物暴露时间在确定细胞毒性机制时的重要性(1）．典型的24小时暴露时间可能太早，无法检测一些凋亡机制(如诺可达唑测定法)。
总的来说，我们发现CyBi®-FeliX液体处理器是进行此处所述的机械细胞毒性实验的一个非常适合的平台。液体处理程序允许测试化合物被连续滴定并应用于细胞;这是一种灵活的，价格具有竞争力的仪器，能够进行必要的分析设置和试剂交付步骤的分析工作流程。加入解冻后使用的细胞提供了可复制的细胞来源，并消除了花时间培养细胞的负担，使用CyBi®-FeliX液体处理器消除了繁重的和更可变的手动液体处理。这样的自动化工作流程为研究人员提供了方便，同时仍然产生一致和可重复的结果。同质“add-mix-measure”细胞健康分析和Promega的GloMax®Discover配对确保了对有意义的细胞细胞毒性分析数据的敏感和优化检测。
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科学文体，2006年第7版
Butzler, M.， Worzella, T.， Hungriano, M.， Osorio, F.， Hanegraaff, I.和Cowan, C.使用CyBi®-FeliX仪器、细胞健康测定和解冻使用细胞进行自动细胞毒性分析。[互联网]2014年12月(tpub_159)。[引:年、月、日]。可从:https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells/
美国医学协会，《文体手册》，2007年第十版
Butzler, M.， Worzella, T.， Hungriano, M.， Osorio, F.， Hanegraaff, I.和Cowan, C.使用CyBi®-FeliX仪器、细胞健康测定和解冻使用细胞进行自动细胞毒性分析。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells/ 2014年12月更新。访问月、日、年。
Caspase-Glo、CellTiter-Glo和GloMax是Promega Corporation的注册商标。CellTox是Promega公司的商标。
CoStar是康宁公司的注册商标。CyBi是CyBio, Inc.的注册商标。GraphPad Prism是GraphPad Software, Inc.的注册商标。
