设计一种生物发光报告分析方法:归一化选择

归一化通常用于许多类型的实验方法中，作为纠正由其他因素而不是直接被测试的因素引起的变化的过程。对于发光遗传报告实验，归一化可能特别有价值，因为常用的瞬时转染方法可以从许多来源引入可变性，如表1所列的那些。包含规范化步骤可以减少可变性，使数据比较更容易，并提高数据的统计显著性和置信度。虽然有许多方法可以考虑归一化，但本文主要集中在使用共转染对照报告时的实验优化和数据分析。

基因报告数据归一化的典型方法包括归一化总蛋白含量、归一化细胞健康(活力)或归一化共转染内控报告。例如，使用Bradford试验对总蛋白进行归一化处理，可以控制细胞总数的变化，并可用于处理稳定转染的细胞，在这些细胞中，变异来源比较有限。然而，蛋白质检测是最不容易的选择(例如，它们不能与报告检测相复用)，因此不在本讨论中考虑。

尽管不一定用于归一化，但将报告基因检测与兼容的细胞活力标记物进行复用提供了一种了解细胞健康背景下报告基因表达的方法。例如，荧光非溶性活性分析可以在发光报告基因分析的上游进行，从而实现对来自同一孔的活细胞和报告基因表达的顺序分析。当使用带有两个实验报告器的单或双报告器测定法时，细胞健康测定法可以更好地解释数据，并解释化合物处理毒性引起的报告器活性降低的原因(图1)。

图1。测定来自同一样品的抗氧化反应元素(ARE)和热休克反应元素(HSE)反应以及细胞活力。HepG2细胞转染pNL[NlucP/ARE/Hygro]和pGL4.41[luc2P/HSE]，并用tBHQ处理。孵育过夜后，使用CellTiter-Fluor™细胞活力测定法测定细胞活力，然后使用NanoDLR™测定HSE和ARE反应。

内部控制报告的归一化通常是控制基于转染的实验中引入的变量的最佳方法。该方法使用与实验载体共转染的构成表达控制报告载体。使用双报告因子分析法(表2)对两者的发光进行顺序测量，并通过计算“实验报告因子活性/对照报告因子活性”得到每个阱的归一化比率。这种方法考虑了由于转染效率、细胞数量、活细胞数量或在平板上的位置引起的边缘效应的差异而引起的孔与孔之间的差异。图2显示了未归一化的单报告因子分析数据与使用双报告因子分析(NanoDLR™或Dual-Glo®)得到的归一化数据的变异系数(CV)的差异。将每口井的数据归一化，可以纠正数据的可变性，并显著降低获得的总体cv，提高数据质量。

图2。使用NanoDLR™或Dual‐Glo®测定法从单个报告读数与规范化数据中获得的变异系数(cv)的比较。对于每种试剂，96孔HEK293细胞板的内部60孔瞬时转染组成性表达的萤火虫荧光素酶和组成性表达的NanoLuc®(NanoDLR™)或Renilla荧光素酶(Dual-Glo®试验)。隔夜培养液被移除后，用PBS和新培养基清洗培养皿。测量萤火虫荧光素酶水平，然后测量NanoLuc®或Renilla分别使用NanoDLR和Dual-Glo。在每个平板上计算个人读取和数据规范化之后的cv。

选择一个控制报告者和启动者

作为内部对照的报告物必须不同于作为实验报告物的报告物，因为两者的活性将在相同的细胞或细胞裂解液中测量(表2)。通常，来自对照报告物的信号应足够高，以便容易和准确地测量，但应较低，以避免干扰实验报告物表达(下文讨论)，并避免检测分析问题(底物耗尽或检测仪器饱和)。幸运的是，剩下的余地非常大。发光报告子和驱动其表达的启动子都对获得的整体信号有贡献。每个报告子/启动子组合的相对发光量取决于所使用的特定细胞类型(图3);因此，应考虑共转染条件，并针对您的特定实验条件进行优化。

图3。萤火虫和NanoLuc荧光素酶在多种细胞类型中表达的本构启动子的相对发光。细胞瞬时转染不同数量的DNA，其中含有CMV、PGK或TK组成启动子表达的萤火虫或NanoLuc®荧光素酶。表达24小时后，使用NanoDLR™检测发光，并计算与TK-NanoLuc®相比较的给出可用信号的DNA数量的近似相对发光。这些值可以指导对照报告结构的选择和适当的DNA转染量或稀释度，以获得所需的信号。

优化co-transfection条件

对照报告蛋白的表达水平也取决于共转染中包含的控制载体的数量，需要确定最佳的实验载体:控制载体比例。通常，您将共转染所需的最小数量，以在后台提供重要的报告器活动。转染大量对照质粒可能导致转录抑制或对实验启动子的其他干扰，即启动子之间的反式效应。图4展示了最小化联合报告人员级别的重要性。Co-transfecting的Renilla10:1(萤火虫:Renilla)的比例使萤火虫的荧光素酶信号下降约50%，在1:1的比例下，观察到对萤火虫信号的抑制近70%。有趣的是，共转染NanoLuc®荧光素酶对萤火虫荧光素酶信号的影响最小，在10:1和1:1转染比下仅产生约20%的抑制。

图4。用NanoDLR™或DLR™检测共报告基因表达水平对萤火虫信号的影响。萤火虫荧光素酶载体质量保持在500ng，而联合报告者(NanoLuc®或Renilla)载体质量变化范围为5 ~ 500 μ g。每种情况N = 8。加入转染载体DNA后，总转染量保持在1μg不变。

为了优化实验条件所需的联合报告者数量，我们建议首先优化实验报告者的条件。接下来，通过共转染不同数量的控制载体，经验地确定联合报告者所需的数量，以找到提供足够应答的最小数量。图5展示了这类优化实验的一个例子，其中萤火虫的水平保持不变，作为实验报告器，而增加tk驱动的联合报告器的数量，Renilla或NanoLuc®荧光素酶被转染。该数据表明，最佳的共报告剂数量将取决于所使用的共报告剂和检测试剂。当使用Renilla荧光素酶作为联合报告剂，您可能需要使用更高的共转染量来获得可接受的信号，特别是在使用Dual-Glo®检测试剂时，应注意确保不观察到对实验报告剂的影响。当使用Renilla荧光素酶作为对照报告者，可能需要一个更强的启动子来获得足够的表达水平。相比之下，即使在最低共转染水平NanoLuc®萤光素酶也能产生稳健的反应，使NanoLuc®对照报告物的使用水平比萤火虫报告物低10,000倍(10,000:1)。此外，我们建议从活性低于CMV启动子的构成启动子(如PGK或TK)中表达NanoLuc®荧光素酶，以获得适当的表达水平。最后，请注意，来自控制报告器的信号不必高于或低于来自实验报告器的信号。

在此浓度下，实验化合物在增加实验报告蛋白表达方面的效果是阳性对照的40%。注意:如果信号的原始发光信号值接近背景发光信号值(来自未转染细胞或纯培养基对照孔)，则需要在计算比值之前减去背景发光值。

在基于瞬时转染的遗传报告实验中，包含一个内部控制报告仍然是减少变异的最有效方法。在设计包含控制报告器的实验时，为了获得最佳结果，需要考虑许多参数。

确定适当的共转染联合报告子、启动子和DNA稀释剂将在很大程度上取决于具体的实验条件，即孔的大小、细胞的数量、细胞被转染的能力和使用的检测试剂。虽然NanoLuc®荧光素酶常被用作敏感的实验报告剂，但它提供了一个极好的替代方案Renilla作为萤火虫萤光素酶的联合记者。它的信号很亮，比Renilla允许NanoLuc®荧光素酶在非常低的稀释度下使用，最大限度地减少对萤火虫荧光素酶报告基因的影响，并减少转染所需的DNA总量。