设计一种生物发光报告分析-选择你的实验报告

当谈到设计一个好的报告试验时，有许多参数需要考虑:我应该在什么细胞中工作?我该如何把我的记者介绍到我的牢房里?我应该如何设计我的报告构造?我应该使用什么控件?你需要考虑的两个基本要素是报告蛋白本身和用于检测报告活性的测定化学。这两种成分的属性共同对测定的质量有很大的贡献。

在我们的生物发光分析中，我们使用三种荧光素酶作为报告酶:NanoLuc®荧光素酶(19kDa)，Renilla荧光素酶(36kDa)和萤火虫荧光素酶(61kDa)。包括失稳定版本的Firefly和NanoLuc®荧光素酶，我们提供5种不同的生物发光报告器和多种检测分析方法。那么，如何选择适合自己的组合呢?首先，让我们看看报告器的特性。

报告分析组分的理想特性

NanoLuc®荧光素酶提供最亮的信号。以每摩尔为单位，NanoLuc®荧光素酶比Firefly或Renilla荧光素酶。这种亮度的差异也可以在细胞中看到，这使得基于NanoLuc®的检测比使用其他荧光素酶的检测更敏感。

图1。NanoLuc®，firefly和Renilla荧光素酶检测。将报告酶与相应的检测试剂混合后，从不同浓度的纯化蛋白中测量发光。NanoLuc®荧光素酶的亮度约为萤火虫或荧光素酶的150倍Renilla同等浓度的荧光素酶。使用的检测试剂为用于NanoLuc®荧光素酶的Nano-Glo®荧光素酶检测试剂，用于萤火虫荧光素酶的ONE-Glo™荧光素酶检测系统试剂和Renilla-Glo™荧光素酶检测系统试剂Renilla荧光素酶。

NanoLuc (Nluc)和Firefly (luc2)荧光素酶具有不稳定版本(NlucP和luc2P)，包含PEST蛋白降解序列，针对它们进行快速降解。PEST序列大大减少了酶的半衰期。一个不稳定的报告将有一个更小的细胞内蛋白质池允许更快，更敏感的反应变化的表达。

Nluc和Fluc报告器之间的半衰期变化如下:

• NlucP - 20分钟
• 1小时
• 3小时
• Nluc - 6小时

在下面所示的实验中，使用NFkB启动子和NlucP、flup、Nluc或Fluc报告基因中的一种构建物来转染HEK293细胞。在时间0时用TNFα处理细胞，诱导NFkB启动子的表达。NlucP结构的反应最快、最强，其次是FlucP结构。

图2。比较NanoLuc®和萤火虫荧光素酶结构之间的光输出和响应动态。在包含5个NF-κB反应元件重复序列的最小启动子的控制下，瞬时转染HEK293细胞编码各种形式的荧光素酶的构建物和100ng/ml rhTNF-α (Cat)处理的复制板。# G5241)为指定的时间。面板。在指定的时间点测量发光。面板B。将处理样品与未处理样品在同一时间点进行比较，计算折叠诱导。

先前的实验测量了对刺激的强烈反应。许多生理反应更为微妙。这四个报告者在测量较弱反应的试验中表现如何?下面的实验表明，当灵敏度有问题时，NlucP是最佳选择。在这些实验中，热休克反应元件(HSE)被用来驱动每个报告基因的表达。用热休克模拟物17- aag[17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔丹霉素)处理细胞，激活hsf1转录因子，进而激活HSE。NlucP报告器构造是唯一一个在背景之上显示显著响应的构造。

选择一种检测方法取决于几个因素。如前所述，报告器的选择将影响信号强度、响应时间和灵敏度。如果您选择Nluc或NlucP作为报告器，您将使用Nano-Glo®荧光素酶检测系统检测活性，该系统在Nluc存在时提供稳定的发光型信号，半衰期约为120分钟。

在许多情况下，萤火虫荧光素酶仍然是一个非常好的报告器选项，并且存在许多结构使用Fluc和flup作为报告器。Fluc报告检测有多种检测化学选项，允许您选择最适合您特定实验需求的检测方法。用于检测萤火虫荧光素酶的测定方法包括“闪光”或“辉光”信号动力学选项。“闪光”检测是指信号强但时间短，需要以注射为基础的试剂输送。相比之下，“辉光”型分析具有较长的信号，无需注射器，但通常信号强度较低。了解更多关于“闪光vs辉光”的知识。下图比较了信号强度和持续时间，使用不同的萤火虫分析辉光信号动力学。Bright-Glo™检测提供了最亮的信号，但它衰减很快。另一方面，Steady-Glo®检测方法以最低的强度提供最一致的信号持续时间。ONE-Glo™和ONE-Glo™EX检测方法非常适合高通量使用。 The ONE-Glo™ EX Reagent has the added advantage of improved stability, allowing you to make up the reagent and store it at 4⁰C for several weeks, simplifying repeat use if you have a set of experiments to run.

图4。五种单辉光动态萤火虫荧光素酶报告酶测定的比较。100微升纯化萤火虫荧光素酶(13.8ng/ml DMEM, 0.1% Prionex®为载体)与100µl Bright-Glo™，One - glo™，One - glo™EX, Dual-Glo®荧光素酶或Steady-Glo®试剂结合在96孔板中。在2小时内周期性测量发光，n = 8。

双报告器分析是控制结果变化或最大化数据的极好方法。萤火虫,Renilla荧光素酶可与双荧光素酶®(闪光动力学)或双glo®(稳定动力学)检测系统一起使用。选择在很大程度上取决于实验所需的灵敏度和信号稳定性。另外，可以在Nano-Glo®双荧光素酶报告分析(NanoDLR™)中结合使用萤火虫和NanoLuc®荧光素酶，以提高双报告分析的灵敏度，并具有稳定的信号动力学。

图5。Dual-Luciferase®化验。以1:1:8的TK-Rluc (Renilla):TK-Fluc(萤火虫):载体DNA或TK-Nluc (NanoLuc®荧光素酶):TK-Fluc:载体DNA检测NanoDLR™，DLR™或Dual-Glo®双荧光素酶检测系统表示。当荧光素酶从同一启动子表达时，NanoDLR™检测为Fluc和Nluc报告子提供明亮、稳定的“发光型”信号。