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用发光法测定病毒诱导的细胞病变效应

安德鲁·奈尔斯1——吉姆·诺亚2林恩·拉斯穆森说2和丹·拉扎尔1
1Promega公司;2南方研究院

出版日期:2013年12月

摘要

病毒疾病在一定程度上塑造了人类历史。病毒流行病和大流行病除了造成严重的发病率和死亡率外,还影响了社会结构,影响了保健和卫生程序。在现代,我们通过教育、卫生和疫苗接种相结合的方式抗击了病毒疫情。最近,抗病毒小分子制剂已被开发出来,以补充这些做法。由于新病毒不断出现,因此需要安全和有效的新疗法。在这里,我们描述了一种新的检测方法,它有望加速发现针对溶细胞病毒的新化合物,同时也提供了对潜在脱靶毒性的洞察。

简介

疫苗接种工作仍然是病毒预防的主要手段。然而,由于病毒池中的抗原漂移和受体免疫反应的可变性,成功疫苗的开发可能是有问题的,甚至是难以实现的。当实验疫苗破坏先天免疫系统,增强病毒吸收和传染性,而不是预防感染时,就会发生其他并发症。此外,在日益全球化的社会中,无特征病毒的出现和传播速度往往使正常的疫苗开发时间表不切实际(1)。因此,需要抗病毒治疗来弥补这种医疗需求。

目前的抗病毒药物通常是有效的,但由于广泛使用,容易产生病毒耐药性。因此,需要新的更有效的药物发现方法来从以前未开发的文库中识别新的抗病毒化合物(2)。因为许多医学上重要的病毒使用裂解生命周期,测量宿主细胞健康的药物发现试验可以反向报告病毒活性(3)。传统上,耗时、繁重、基于形态学的斑块分析被用来评分细胞病变效应(CPE)。更多定量的细胞活性化学物质,如四唑族化合物(WST-1, XTT, MTT和MTS)也被用于通过测量细胞完整性的变化来定义病毒感染性。然而,由于敏感性差或多步骤或两者兼有,这些分析方法不适合高通量筛选(HTS)。

我们已经开发了一种生物发光检测方法,可以测量细胞ATP,细胞中的一种严格调控的分子,它可以作为宿主细胞活力的极好替代品。在这里,我们使用四种临床显著病毒和四种宿主细胞系来证明,在筛选和表征药物发现的抗病毒化合物效力时,病毒ToxGlo™检测可以确定样本中的相对病毒负担。此外,该试验还可以很容易地配置为监测疫苗开发试验,通过测量免疫受试者的血清中和潜力或针对病毒靶点的免疫细胞反应,或两者都测量。

开发细胞/病毒感染模型

了解和优化宿主细胞健康和病毒感染参数是任何成功的体外溶细胞病毒学工作的关键步骤(4)。例如,病毒传染性很大程度上受宿主细胞受体表达和分布的影响。确定易感宿主细胞(称为病毒趋炎性)和易感的最佳条件(通常与细胞周期、传代水平和培养条件有关)可以改善CPE和检测结果。在实验上,这是通过滴定宿主细胞在存在预定过量的病毒。对无病毒的宿主细胞进行滴定是建立ATP检测试验线性反应范围的必要条件。

一旦确定了宿主细胞密度和线性反应范围,就需要确定病毒/宿主细胞接触的暴露期。暴露时间过短可能导致次优CPE。如果暴露时间过长,可能会对未感染或未处理的对照细胞的健康产生不利影响。这两种情况都会对病毒ToxGlo™检测的动态范围产生不利影响。

在本研究中,甲型流感病毒(亚型H1N1)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、登革病毒(DENV2)和呼吸道合胞病毒(RSV)分别在Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)、Vero E6肾细胞、小鼠肾细胞(bkh -21)和A549(人腺癌肺泡)细胞上进行了传染性优化(数据未显示)。

建立组织培养感染剂量(TCID)

一旦感染模型得到优化,就可以确定相对感染病毒滴度。在这一步中,A型流感病毒、VEEV、登革病毒和RSV工作池按半对数增量顺序稀释,并应用于各自的宿主细胞。培养基仅用于控制宿主细胞孔作为无病毒对照。根据CPE的动力学(在模型开发过程中确定),病毒滴定孵育72-144小时。制备ATP检测试剂,等量应用于检测板(图1)。测量发光并与病毒稀释相关。含有传染性病毒的稀释剂显示细胞活力低,因此由于广泛的CPE发光值低。相反,不含病毒或限制病毒的稀释剂显示出更高的发光值。通过确定将未经处理的发光信号降低50%的病毒稀释度,得到每种病毒的TCID50值(图2,面板A、B、C和D)。

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图2。TCID50决心。流感(H1N1;板一个), veev (面板B)、登革病毒(面板C)或RSV (面板D)稀释后分别应用于MDCK、Vero E6、BHK-21和A549单分子膜。流感病毒和VEEV病毒稀释剂孵育72小时,而登革热病毒和RSV病毒分别暴露96和144小时。使用GraphPad™Prism计算TCID50。

描述目标上和目标外的效力

Viral ToxGlo™技术还可以建立抗病毒和安全相关的效力。抗病毒药物,利巴韦林和干扰素β (IFN-β),分别以半对数或两倍序列稀释,并应用于宿主细胞。随后,将A型流感病毒、VEEV、登革病毒和RSV以相当于其各自TCID50的100倍的浓度添加到靶标复制井组的每口井中。脱靶组井接收无病毒介质,以解决剂量依赖性药剂效应。经过适当的暴露时间后,制备ATP检测试剂并如前所述添加到板上。对病毒(靶上)和介质(靶外)暴露的发光进行了测量,并与抗病毒药物浓度相关。针对每种病毒和药剂的组合,确定抗病毒药剂的有效效力,并用EC50值表示,即防止50%宿主细胞死亡的药剂浓度(图3,面板A、B、C和D)。脱靶毒性数据绘制在相同的图表上,并与存在细胞毒性的情况(利巴韦林对BHK-1细胞)相匹配。

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图3。对靶标上和靶标外抗病毒效力进行表征。将利巴韦林或IFN-β连续稀释后应用于MDCK、Vero E6、BHK-21和A549单分子层。流感(板一个)或登革病毒(面板B)的100X TCID50应用于含有利巴韦林的MDCK或BHK-21,而100X TCID50的VEEV (面板C)或RSV (面板D)作用于含有IFN-β的Vero-E6或A549细胞。将无病毒的培养基添加到含有抗病毒药物的复制孔中,以建立脱靶、化合物相关的细胞毒性。使用GraphPad™Prism计算EC50值。

演示高通量筛选实用程序

最后的实验探索了使用病毒ToxGlo™检测高通量筛选(HTS)。从烯胺化学多样性库中筛选出3万个化合物,作为单剂量在384孔板中筛选,以对抗三种甲型流感毒株。在有烯胺化合物存在的MDCK细胞中,以100X TCID50剂量注射H1N1、H3N2和H5N1。在每个平板上排列感染和未感染对照孔,以统计评估检测的稳健性。细胞与文库化合物孵育72小时后,将ATP检测试剂添加到384孔板中,测量发光。抗病毒“命中”定义为那些证明至少降低50%的病毒细胞毒性的化合物,有320个化合物符合这一标准(数据未显示)。最后,计算每个平板的Z´值,以评估与感染和未感染对照相关的动态范围和变化(图4,面板A、B和C)。

健壮和可重复的结果。

图4。演示了病毒ToxGlo™检测在HTS筛查中的效用。感染和未感染H1N1流感的对照井(板一个), h3n2 (面板B)及H5N1 (面板C)测试板进行Z´分析,以确定在该筛选环境中的动态测定范围和变异。数据以Z´因子与单个板块的比值表示。Z′> 0.5被认为对高温ts活动足够稳健。

总结

病毒ToxGlo™检测是一种简单的“添加-混合-测量”均质检测,用于监测病毒诱导的细胞病变效应。它提供了一种高度敏感、精确和定量的CPE测量方法,具有简单和快速的工作流程,与其他方法相比具有优势。该试验成功建立了TCID50和已知抗病毒化合物对医学相关病毒靶点的靶向和脱靶效力。此外,我们演示了病毒ToxGlo™检测HTS的使用,使得在筛选环境中使用该检测成为可能,并促进寻找新的,更有效的化合物。

病毒ToxGlo™检测是一种简单的、可量化的方法,用于测定由溶解病毒粒子引起的宿主细胞中的病毒诱导细胞病变效应(CPE)。
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参考文献

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21059874?dopt=AbstractPlusMaddry, J.A.等(2011)从细胞高通量筛选中发现新型苯喹唑啉酮和噻唑咪唑,它们是H5N1和H1N1流感病毒的抑制剂。j . Biomol。屏幕,16,73 - 8。
  2. Severson, W.E.等人(2008)a型流感病毒(H3N2)抑制剂10万个化合物文库的高通量筛选j . Biomol。屏幕,13,879 - 87。
  3. 麦科伊,M.H.和王娥(2005)使用细胞-底物阻抗传感作为工具实时量化a型流感病毒感染MDCK细胞的细胞病变效应。j .性研究。方法130,157-61。
  4. 诺亚,J.W.等人(2007)一种基于细胞的发光分析是高效筛选潜在的流感抗病毒药物的有效方法。抗病毒决议73、50-9。