用多重分析方法鉴别谷胱甘肽水平的变化与细胞毒性事件
Promega公司
出版时间:2013年10月;tpub 135
摘要
将谷胱甘肽水平的变化作为一个单一终点来衡量，可能无法提供足够的信息来区分谷胱甘肽的减少与细胞毒性事件。细胞毒性测定常在平行样品中进行。测试化合物对培养细胞的细胞毒性和氧化效应可以使用CellTox™绿色细胞毒性试验和GSH/GSSG-Glo™试验来确定。在这里，我们证明了这两种分析方法可以在单井中进行多路复用。使用不同浓度的menadione或l- buthiionine Sulfoximine (BSO)处理的HEK-293贴壁细胞和K-562悬浮细胞，这两种化合物已知会影响总谷胱甘肽(GSH + GSSG)水平，我们在单独的试验和多次试验中对细胞进行了分析。我们发现，在细胞中添加CellTox™绿色染料对GSH/GSSG-Glo™实验产生的后续发光信号没有显著影响。
简介
谷胱甘肽是一种存在于真核细胞中的抗氧化剂，通常以还原形式存在(GSH)。细胞内的一小部分谷胱甘肽处于氧化状态(GSSG)，它呈二聚体的形式，由两个谷胱甘肽分子的半胱氨酸之间的二硫键连接。因此，GSSG是细胞氧化应激的良好指标。GSH/GSSG-Glo™检测是一种基于发光的系统，用于检测和定量氧化和还原状态下的谷胱甘肽。这种稳定的发光是由谷胱甘肽s -转移酶将谷胱甘肽探针荧光素- nt转化为荧光素产生的。这种转化为荧光素的过程与萤火虫荧光素酶反应相结合，产生与谷胱甘肽含量成正比的发光信号。这些测量可以计算谷胱甘肽/谷胱甘肽的比例，或还原谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽的比例，以确定培养的哺乳动物细胞对化合物的反应中存在的氧化应激。
为了定量氧化和还原形式的谷胱甘肽，GSH/GSSG- glo™试验使用两种反应构型来独立定量GSH和GSSG(图1)。
图1。谷胱甘肽/ GSSG-Glo™分析概述。GSH依赖的GSH探针，荧光素- nt，通过谷胱甘肽s -转移酶转化为荧光素，与萤火虫荧光素酶反应耦合。
CellTox™绿色细胞毒性检测是一种荧光染料基检测，用于确定实验化合物对培养细胞的细胞毒性效应。这种染料不能穿过存活的细胞膜，因此只能通过死亡细胞受损的细胞膜与DNA结合(图2)。这种染料基本上是无毒的，一旦与DNA结合，就会产生稳定的荧光信号，可持续72小时。这种荧光信号与细胞毒性成正比。
图2。CellTox™绿色细胞毒性检测。CellTox™绿色染料与细胞膜完整性受损的细胞DNA结合，显示荧光增强。在本报告中，我们展示了将CellTox™绿色细胞毒性检测与GSH/GSSG-Glo™检测相结合的有效性，以确定化合物对单个培养细胞的细胞毒性和氧化效应。用甲二酮或BSO处理培养的哺乳动物细胞:甲二酮增加谷胱甘肽的氧化，而BSO抑制细胞内谷胱甘肽的合成。由于CellTox™绿色染料可以通过在电镀时直接将染料添加到细胞中以“无步骤”的形式添加，因此可以在GSH/GSSG-Glo™试验之前进行CellTox™绿色细胞毒性试验，而无需更改任何协议。该实验在存在和不存在CellTox™绿色染料的情况下进行，以确定荧光染料是否对GSH/GSSG-Glo™检测的后续发光信号有影响。
材料和方法
- 谷胱甘肽/ GSSG-Glo™试验(猫。# V6611)
- CellTox™绿色细胞毒性试验(Cat。# G8741)
- 甲萘醌(σ,猫。# M5625)
- l-丁硫胺磺胺(Sigma, Cat。# B2515)
- 洋地黄皂苷(σ,猫。# D141)
- hek - 293细胞
- k - 562细胞
注意:细胞系采用STR基因分型(GenePrint®10系统，猫。# B9510)。
每孔1万个细胞镀于白色96孔板中(表1)。细胞按B-G行和2-10列镀，其余孔镀100µl的DMEM或Hanks平衡盐溶液(HBSS)。对于每一个实验，细胞都被电镀了两份，其中一个平板含有根据CellTox™绿色细胞毒性试验技术手册#TM375中描述的快速，种子无步骤添加协议添加的CellTox™绿色染料(每5ml细胞10µl的CellTox™绿色染料)。对于每个处理，一个柱含有30µg/ml的洋地黄苷作为细胞毒性阳性对照。车辆控制井和无单元控制井也包括在内。
| 表1。CellTox™绿色检测与GSH/GSSG-Glo™检测复用的检测规范。用menadione或BSO处理HEK-293或K-562细胞。用CellTox™绿色细胞毒性试验检测细胞毒性，用GSH/GSSG-Glo™试验检测氧化应激。 | |||
| 试验步骤 | 贴壁细胞- Menadione |
粘附细胞- BSO |
悬浮细胞- Menadione |
| 细胞电镀(细胞重复电镀，每5ml细胞添加10µl CellTox™绿色染料到一组重复孔) | HEK-293贴壁细胞在100 μ l DMEM中 | 50 μ l DMEM的HEK-293贴壁细胞 | 20 μ l HBSS的K-562悬浮细胞 |
| 37℃，5% CO孵育2 | 24小时 | 4个小时 | 没有一个 |
| 化合物剂量 | 10µl甲萘醌 (3.125 -25µM) |
50µl BSO (15.6µM - 500µM) |
5µl甲萘醌 (3.125 -25µM) |
| 37℃，5% CO孵育2 | 1小时 | 18个小时 | 1小时 |
| CellTox™绿色荧光读数 | 含有CellTox™绿色染料的板在490nm处读取前女友/ 510 - 550 nm新兴市场 | ||
| GSH/GSSG-Glo™检测(按照谷胱甘肽(GSSG) - - -如果™分析技术手册# TM344) | 测定前吸取培养基 | 在培养基中测定 | |
| 谷胱甘肽/ GSSG-Glo™发光阅读 |
所有板分析如所示谷胱甘肽(GSSG) - - -如果™分析技术手册# TM344 | ||
结果
我们使用GSH/GSSG- glo™试验来监测GSH和GSSG水平，并观察给药后HEK-293细胞和悬液K-562细胞的氧化应激(图3和4)。我们还使用CellTox™绿色细胞毒性试验对细胞进行了menadione的细胞毒性效应分析。与对照对照相比，连续稀释menadione后的细胞在任何浓度下均无细胞毒性。这表明该化合物并没有杀死细胞(图3，面板A和图4，面板A)。相比之下，添加洋地黄苷，一种清洁剂作为阳性对照，导致细胞毒性信号大幅增加。为了确定menadione对细胞的氧化应激作用，我们监测了GSSG水平(图3，面板B和图4，面板B)。氧化谷胱甘肽水平随着menadione浓度的增加而增加，表明氧化酶应激。menadione在25 μ M时，HEK-293细胞氧化谷胱甘肽的量较对照增加了13.3倍，K-562细胞氧化谷胱甘肽的量较对照增加了11.5倍。随着甲二酮浓度的增加，总谷胱甘肽水平略有下降(图3，图C，图4，图C)。
图3。Menadione对HEK-293细胞的作用。在有和没有CellTox™绿色染料的情况下，用menadione处理HEK-293细胞1小时后，对其进行GSH/GSSG-Glo™检测。面板一个。在GSH/GSSG-Glo™检测培养基吸入之前进行CellTox™绿色细胞毒性检测。面板B。氧化谷胱甘肽(GSSG)值。面板C。总谷胱甘肽值。灰色条表示仅GSH/GSSG-Glo检测，而绿色条表示与CellTox™绿色细胞毒性检测复合的GSH/GSSG-Glo检测。
图4。Menadione对K-562细胞的作用。在有和没有CellTox™绿色染料的情况下，用menadione处理K-562悬浮细胞1小时后，对其进行GSH/GSSG-Glo™检测。面板一个。CellTox™绿色细胞毒性检测。面板B。氧化谷胱甘肽(GSSG)值。面板C。总谷胱甘肽值。对于B/C:灰色条表示仅GSH/GSSG-Glo™检测，而绿色条表示与CellTox™绿色细胞毒性检测复合的GSH/GSSG-Glo™检测。
为了观察l-丁硫胺磺胺(l-Buthionine Sulfoximine, BSO)给HEK-293细胞的贴壁GSH变化，我们使用GSH/GSSG-Glo™检测来监测总GSH水平(图5)。BSO是一种已知的细胞GSH合成抑制剂。细胞还使用CellTox™绿色细胞毒性试验来检测BSO的细胞毒性效应。与对照对照相比，连续稀释BSO后的细胞没有表现出细胞毒性，表明该化合物没有杀死细胞(图5，面板a)。添加阳性对照洋地黄苷，导致细胞毒性信号大幅增加。我们使用GSH/GSSG-Glo™检测检测BSO给药细胞中GSH的变化(图5，图B)。随着BSO浓度的增加，总谷胱甘肽水平与对照相比下降。当浓度为25 μ M BSO时，总谷胱甘肽含量比对照组降低了12.3倍。BSO不会导致谷胱甘肽氧化(数据未显示)。在CellTox™绿色染料存在的情况下，检测到的总谷胱甘肽水平没有显著差异，表明这两种检测方法的多路复用没有不良影响(对比绿条和灰条，图5，面板B)。
图5。l-Buthionine Sulfoximine (BSO)对HEK293细胞的作用。在存在和不存在CellTox™绿色染料的情况下，在BSO处理18小时后，对HEK-293细胞进行GSH/GSSG-Glo™检测。面板一个。在GSH/GSSG-Glo™检测培养基吸入之前进行CellTox™绿色细胞毒性检测。面板B。总谷胱甘肽值(BSO不会导致谷胱甘肽氧化，数据未显示)。灰色条表示仅GSH/GSSG-Glo检测，而绿色条表示与CellTox™绿色细胞毒性检测复合的GSH/GSSG-Glo检测。
结论
在GSH/GSSG-Glo™检测之前，可以使用粘附细胞和悬浮细胞进行CellTox™绿色细胞毒性检测。CellTox™绿色染料的存在对GSH/GSSG-Glo™检测发光信号没有显著影响。这些系统的多路复用允许在同一井中测量氧化应激和细胞毒性，而对协议进行最小的更改。
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如何引用这篇文章
科学文体，2006年第7版
Truman, A.和Hook, B.用多重分析方法区分谷胱甘肽水平的变化与细胞毒性事件。2013年10月(互联网);tpub 135。[引用:年，月，日]。可以从https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/differentiating-changes-in-glutathione-levels-from-cytotoxic-events/
美国医学协会，风格手册，第10版，2007年
Truman, A.和Hook, B.用多重分析方法区分谷胱甘肽水平的变化与细胞毒性事件。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/differentiating-changes-in-glutathione-levels-from-cytotoxic-events/ 2013年10月更新;tpub 135。访问月日，年。
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