生物发光优势
Promega公司
出版时间:2007
摘要
虽然科学家可以利用一系列的光子发射化学来服务于不同的实验目的，但越来越多的生物发光正成为许多类型分析的首选。本文概述了生物发光给生物分析方法带来优势的潜在原因。
生物发光的案例
在生命科学研究中使用的许多分析技术中，光子发射化学因其固有的高灵敏度和使用简单而最受欢迎。这些化学物质是根据产生光子所需能量的获取方式进行分类的。荧光可以说是应用最广泛的化学，也被称为光致发光，因为它依赖光子作为能量来源。其他例子包括依赖化学能的化学发光;辐射发光，依赖于放射性(例如，闪烁体);还有电致发光，它依赖于电。
生物发光是化学发光的一种形式，发光反应来自于自然催化的过程，例如发光的萤火虫、水母、细菌和其他生物中发现的酶反应。生物发光化学在各种生物分析方法中越来越受欢迎，因为它们可以提供比荧光分析高10到1000倍的分析灵敏度。当应用于复杂的生物样品时，这种大大增加的灵敏度可以大大提高检测性能。在检查光产生的机制以及它如何影响到分析方法的实施时，原因是显而易见的。(1）
在所有发光化学中，能量被发光分子吸收以产生激发态中间体。当能量从激发态释放到相应的基态时，就会产生光(图1)。由于发光化学是根据激发态的产生方式来区分的，这也从根本上影响了它们作为分析技术的表现。在荧光和生物发光中，这种差异反映在它们的相对信号强度和信号背景比上。
图1。荧光和生物发光的激发和发射模式。年代0，基态;年代2，激发态;年代1，振动松弛后的激发态。
由于产生激发态的光子可能以非常高的速率引入样品，因此使用荧光的分析可以相对较亮。然而，光子的大量涌入也会导致更高的背景，这主要是由于两个因素:光电探测器在区分激发光子和发射光子方面的负担，以及来自生物样品中通常存在的其他弱荧光团的干扰。在荧光分析中，加入样品的“前荧光团”可能是造成高背景的最严重的违法者。
虽然荧光报告器在分析中的信号与这些其他过程相比应该是相对有效的，但重要的是要记住，被引入样品的光子数量通常相对于报告器产生的光子数量是巨大的。因此，荧光分析中的净背景通常是显著的。相比之下，虽然生物发光分析通常产生较低的光强度，由于激发态可以创建的较慢的速率，但由于没有光子引入到样品中，因此几乎不存在分析背景。
亮度和背景之间的这种关系对这些分析技术在各种应用中的适用性具有重要的影响。在光子检测受限的情况下，检测背景在很大程度上取决于检测仪器的能力。这就是细胞显微镜和流式细胞术等技术的情况，检测单个细胞所需的光学限制了光的聚集能力。在这些情况下，测定化学的亮度成为主要考虑因素，因此荧光通常是首选。
然而，对于较大的样品，其中光学要求更简单，光子检测变得更有效，分析化学中固有的背景变得更加重要。这适用于在单个样管或多孔板(例如，96孔板和384孔板)中进行的测量，或在较大的生物(如小鼠)中进行的图像分析。在这些情况下，非常低的背景特征的生物发光分析可以提供实质上更大的灵敏度。此外，光子检测通常对生物发光更有效，因为光谱分辨率不需要光学滤光片或单色器，而且光电探测器通常可以放置在离样品更近的地方。
结果是，生物发光可以常规测量到接近10的水平-20年摩尔-每个样品少于10,000个分子。对于一个典型的生物样本，这相当于每个细胞含有几个分子。此外，这种高灵敏度允许非常大的动态范围。大多数生物发光分析是线性的6到8对数的分析物浓度。幸运的是，作为定量生物发光的首选仪器，光度计能够在这些非常大的范围内工作。
生物发光作为一种检测工具的效用通过两个额外的特征进一步加强。首先，光子发射能力是在生物环境中自然进化的，因此与生物系统广泛兼容。第二，光子发射分子，荧光素，在酶的结构中是绝缘的。这保护了能量转换过程，并支持最佳的量子产量。
为什么不是荧光蛋白?
生物发光在生命科学研究中最常见的应用是作为基因报告者，通常作为一种监测基因转录动态的手段。萤火虫荧光素酶通常是首选的选择-一种61kDa的单体蛋白，作用于萤火虫荧光素，ATP和氧气，产生黄-绿光(560nm)。因此，萤火虫荧光素酶作为细胞生理学的细胞内探针，因此，应该配置为最大限度地减少对正常细胞过程的影响。
尽量减少细胞内探针影响的最好方法之一是在低浓度下使用它，这可以最大限度地减少可能由引入外源性成分引起的生理压力。除此之外，细胞内探针通常通过耦合或集成到特定的细胞过程中发挥作用，因此它们的存在可以影响这一过程。例如，探针的浓度可能开始超过这些过程的正常容量，潜在地导致减弱或人为行为。因此，通常建议将细胞内探针的浓度保持在最低水平。
这就是生物发光的敏感性提供了一个巨大的优势，特别是与荧光蛋白(如GFP)相比，后者被广泛用于活细胞内的分子过程成像。荧光蛋白在这方面非常有价值，因为光子发射足够亮，可以提供生动的显微图像。然而，为了实现清晰可识别的信号，荧光蛋白通常由强启动子如CMV表达。尽管荧光素酶不太适合用于细胞成像，但它们可以作为转录调节的探针，其浓度远低于荧光报告器。
另一个对基因报告器性能很重要的方面是反应动力学。高度稳定的报告基因倾向于抵抗与转录率变化相关的细胞内浓度的变化。因此，报告者可能无法准确地反映活细胞中潜在的转录动态。动态响应可以通过将蛋白质降解信号合并到报告中(例如，PEST序列)来改善，但这也会减少报告细胞内的积累，并降低检测灵敏度。尽管如此，由于发光分析固有的高灵敏度，这种策略对荧光素酶报告者工作得很好。相比之下，荧光蛋白通常是高度稳定的，降解信号的加入会限制检测的灵敏度。
荧光素酶报告器的动态能力可广泛应用于细胞生理学的研究。在图2所示的例子中，通过添加激动剂异丙肾上腺素刺激HEK293细胞中的天然β2-肾上腺素受体。在Gα中年代-偶联受体，细胞膜上的刺激通过增加细胞内cAMP在细胞内传递，cAMP反过来通过cAMP反应元件(CRE)激活基因表达。受体活性可以通过偶联荧光素酶报告基因上游的CRE来监测。
图2。β - 2肾上腺素能受体的生物发光报告试验。纳入荧光素酶报告的降解序列增加了反应的速率和相对大小。面板。卢克2、萤火虫荧光素酶;卢克2P，萤火虫荧光素酶与PEST序列(-Pro-Glu-Ser-Thr);卢克2CP，萤火虫荧光素酶与CL1和PEST序列。面板B。HEK293细胞稳定表达荧光素酶报告基因偶联camp反应元件(CRE)。1 μM异丙肾上腺素/ 100μM RO-20-1724诱导内源性β2-肾上腺素能受体。
使用优化的pGL4荧光素酶报告载体，在添加激动剂后，报告基因的表达被刺激了200倍(图2)。此外，通过添加降解序列，这种响应的速率和幅度得到了提高。pGL4载体中的荧光素酶基因经过密码子优化，可用于哺乳动物细胞，以确保最大的表达效率。此外，转录因子的共识结合位点也被移除，以最大限度地减少宿主与载体发生意外相互作用的可能性。
生物发光的广泛适用性
生物发光反应产生的光强度取决于组分反应物的浓度，通过对这些组分的化学偶联，可以与各种分子过程相关联。通常，一个实验中所有成分的浓度都保持不变，只有一种成分的浓度可以随感兴趣的过程而变化。对于报告基因分析，可变成分是酶本身偶联到基因表达。但底物，如ATP或荧光素，也可以作为可变组分(图3)。
图3。使用生物发光的分析策略。卢克，萤火虫荧光素酶基因;Ultra-Glo™rLuciferase，一种高度稳定的萤火虫荧光素酶变体;细胞色素P450;
荧光素可以以类似于荧光测定的方式纳入测定设计。通过添加修饰基团，荧光素对发光反应变得不可用，直到通过某些生化过程去除修饰剂。例如，荧光素衍生物Asp-Glu-Val-Asp-6 ' -氨基荧光素在四肽序列被caspase-3蛋白酶裂解之前不能支持发光。通过这种方法，荧光素衍生物提供了一种检测细胞凋亡的敏感方法。通过将四肽偶联到适当的荧光团如罗丹明，可以进行类似的细胞凋亡荧光测定。然而，在类似条件下进行比较时，生物发光法的灵敏度提高了近100倍(图4)。灵敏度的提高是由于背景大大减少，这也提供了一个扩展的线性范围。
该方法可应用于其他蛋白酶，包括caspase-8、caspase-9、DPPIV、calpain和蛋白小体，结果相似。它也可以用来测量CYP450活性，单胺氧化酶活性，或各种其他酶裂解反应。
图4。caspase-3/7活性的生物发光和荧光测定。面板。z - devd -氨基荧光素上caspase裂解的分析方法。面板B。在抗fas处理的Jurkat细胞上进行分析，并连续稀释到96孔板中。在加入试剂1小时后进行测量，并从不含细胞的孔中测量背景。信噪比计算方法为均值测量减去均值背景，再除以背景标准差。面板B经O 'Brien硕士许可转载et al。(2005)j . Biomol。屏幕上。10137 - 48。
ATP的检测是生物发光最古老的应用之一，作为一种快速检测细胞活力的方法继续受到欢迎。对哺乳动物细胞的测定比常用的基于四氮唑的测定灵敏度高100倍以上，只需约5分钟。细菌活力的类似生物发光测定对~100个细胞敏感，这取决于细胞类型。ATP的生物发光分析也可用于测量消耗ATP的酶，最显著的是激酶。这种方法的优点是几乎适用于激酶活性，无论磷酸受体是蛋白质、脂类还是多糖。
最近的一项策略是将荧光素酶和蛋白激酶A (PKA)结合起来进行cAMP检测。培养细胞释放的cAMP调节检测试剂中的PKA活性，进而作用于生物发光反应所需的ATP。这两种反应的结合可以快速、灵敏地测定培养细胞中g αs偶联受体或磷酸二酯酶活性。
生物学的独特灯塔
生物发光化学在生命系统的巨大复杂性特征中找到了最大的潜力。反应成分可能存在于复杂的生化环境中，数量微乎其微，但它们传递了清晰而定量的信号。这种能力是通过在一个黑暗的环境中成为唯一的光子玩家来实现的。唯一存在的光子是由这种独特的化学反应产生的，在不同的环境中赋予了一个基本的奇点。
因此，在光子发射化学中，生物发光是揭示分子过程秘密的灯塔。
相关产品leyu乐鱼网
了解生物发光反应的化学性质及其在广泛测定中的应用。LabFact # 29
生物发光测定法的灵敏度比荧光测定法高10到1000倍。更多的信息关于生物发光和荧光。
如何引用这篇文章
科学文体，2006年第7版
《生物发光的优势》。(互联网)2007。[引:年、月、日]。可从:https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/enotes/the-bioluminescence-advantage/
美国医学协会，《文体手册》，2007年第十版
《生物发光的优势》。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/enotes/the-bioluminescence-advantage/ 2007年更新。访问月、日、年。
leyu乐鱼网产品可能涉及未决或已颁发的专利，或可能有某些使用限制。
