MSI检测的发展

自1993年微卫星不稳定性被发现以来，它一直是分子肿瘤研究人员的主要兴趣，包括最近的发现，将MSI状态与免疫治疗反应联系起来。Jeff Bacher博士一直致力于MSI检测的前沿工作。

25年前，三个实验室同时发现了肿瘤发展的独特机制。在寻找结直肠肿瘤杂合性缺失(LOH)时，他们发现从肿瘤和正常相邻组织中提取的非编码区域的某些PCR条带的大小发生了变化。经过进一步的研究，他们发现许多有问题的带包含微卫星，特别是多腺嘌呤束(1-3)。扩增子大小的变化被证明是由失配修复的缺陷引起的。这种情况被称为“微卫星不稳定(MSI)”，很快其他实验室开始在他们感兴趣的癌症中寻找MSI。从那时起，MSI的研究得到了极大的扩展，最近关于MSI状态和免疫治疗反应之间联系的发现增加了人们的兴趣。

Promega研究科学家Jeff Bacher博士自1993年首次发现这一现象以来一直在观察这种进化。他在第一个基于pcr的MSI检测标准化套件的创建中发挥了不可或缺的作用，并与该领域的许多著名思想领袖密切合作。我和Jeff在Promega研发中心坐下来聊了聊MSI研究的历史，他现在在做什么，以及他希望在未来看到什么。

Jeff告诉我:“我在(Promega)工作了20多年。根据他的员工资料，26岁。杰夫是一个悠闲的中年人，语速很快，对于复杂的话题，他会毫不犹豫地进行更长的解释。他是一名分子遗传学家，获得了密歇根州立大学的博士学位。在我们交谈时，他偶尔会跳起来在白板上画图表，急切地想帮助我理解他在Promega所做的大量工作。

“我在这里的大部分时间……我在Doug (Storts)的小组，我们使用短串联重复(STRs)。最初的主要目的是为法医开发新的标记。因此，由此产生了一些五核苷酸重复序列，我们仍然在法医套件中使用，”杰夫说。“那时，当我在做那个项目时，有很多关于MSI的论文出来了。但是所谓的MSI并没有标准，所以每个人都使用他们拥有的任何标记——这是一种巨大的混乱。他们用实验室里的任何标记物对他们感兴趣的肿瘤进行检测。正因为如此，在1994年，我开始对检测癌症中的MSI感兴趣。”

MSI检测的新标记
为了解决他在现场看到的标准化标准的缺乏，Jeff开始研究MSI检测的新标记面板。他从最近在法医项目中使用的五核苷酸开始研究。五核苷酸被选中是因为它们异常低的口吃，这是在PCR过程中滑移的影响。(在电泳图上，口吃看起来要么是一个模糊的峰，要么是两个大小相近的相邻峰。)在法医学中，理想的标记不会出现结巴现象，因为在可能混合的样本中，很难确定数据中的伪迹是PCR错误造成的，还是代表一个完全不同的人。事实证明，用于法医的低口吃五核苷酸重复序列实际上是MSI检测中最糟糕的可能标记。

“他们就是不敏感。当你做PCR时，你基本上是在放大DNA而没有所有的细胞修复机制来消除任何错误。所以你从PCR中得到的和你在一个没有修复机制的细胞中发现的是一样的。如果你有一个标记，当你做PCR时显示很多口吃，那么你有一个标记将对MSI敏感，因为它很容易在复制过程中出错。”

杰夫不得不改变他的观点，以寻找对MSI敏感的标记。低口吃五核苷酸显然是糟糕的选择，所以他走了另一个极端，测试了单核苷酸重复。“当然，我意识到，单核苷酸重复是最敏感的。大约在那个时候，有一个NCI研讨会。这是一个关键的历史时刻。”

第一次nci主办的MSI会议于1997年在马里兰州的贝塞斯达举行。这次会议产生了一篇开创性的论文，详细介绍了MSI检测的第一套国际标准。MSI第一次有了一个标准化的定义:“与正常组织相比，肿瘤微卫星中重复单元的插入或删除导致的任何长度的变化。”论文还列出了推荐的标记列表，其中包括带有三个二核苷酸标记的BAT-25和BAT-26。这个小组后来被称为贝塞斯达小组。

杰夫说:“考虑到这一切，我们改用了一个有所有单核苷酸重复序列的面板。”他开始测试他在GenBank中发现的一些单核苷酸，以及Bethesda面板中最好的(BAT-25和BAT-26)和其他研究人员之前已经识别的几个标记(5)。通过这些测试，他组装了由5个单核苷酸组成的面板，这将成为试剂盒的基础。

Promega在2004年发布了微卫星不稳定性分析工具包。除了用于比较肿瘤和正常相邻组织微卫星长度的单核苷酸重复序列外，该试剂盒还包括两个用于验证的五核苷酸重复序列。选择这些是因为，基于Jeff在从法医到MSI的过渡过程中的原始研究，它们绝对是他所能找到的MSI最差的标记。它们表现出低的变异和对MSI的敏感性，所以它们被包括在试剂盒中，以帮助检查两个被测试的样本是否来自同一个人。如果分析显示五核苷酸之间不匹配，很可能是样品污染造成的。

MSI检测与免疫治疗

2015年，在最初的MSI分析试剂盒推出十多年后，随着《新英格兰医学杂志》(New England Journal of Medicine)上发表的论文《PD-1封锁配错修复缺陷肿瘤》(PD-1 Blockade In tumor with Mismatch Repair Deficiency)，对MSI研究的兴趣激增(6)。研究人员早就知道，MSI癌症患者通常比没有MSI的癌症患者预后更好。例如，在结直肠癌(CRCs)中，约15%的肿瘤表现为MSI，肿瘤通常侵袭性和转移性较低，KRAS或p53突变的可能性较小，在典型治疗条件下预后较好(1)。

然而，Le博士和她的同事们证明了MSI的状态与对免疫治疗异常强烈的反应相关。在一项关于PD-1阻断在结直肠癌中的作用的研究中，33个样本中只有1个显示出反应。后来，作者在这个样本中发现了错配修复缺陷。他们发现，具有这种缺陷的肿瘤有大量靶向新抗原的免疫细胞浸润，但它被PD-L1等免疫抑制配体所抵消，PD-L1与PD-1结合，阻止T细胞激活。当PD-1被阻断时，免疫细胞可以激活并攻击肿瘤细胞。作者发现，即使在单剂量治疗后，患者血清也反映出临床益处(6)。

这篇论文展示了免疫治疗在CRCs中的潜在疗效，但更广泛地，它证明了评估肿瘤基因组可以帮助指导免疫治疗。这是癌症个性化治疗的一大进步，结果，人们对MSI的兴趣激增。

“现在，人们可以使用很多其他方法来确定对免疫疗法有反应的患者，”杰夫说。“总突变负担，PD-1/PD-L1水平，只是一般观察患者的免疫反应。现在也有人正在通过NGS(下一代测序)进行MSI !他们中的一些人这样做是作为一个癌症基因面板的副产品，它碰巧有重复，但他们仍然在他们测序的基因内含子的重复中寻找MSI。这让我想知道-它是否有意义做一个NGS版本的套件?好吧，我在这里不谈这个……”

展望未来

今天，Jeff参与了几个合作项目，探索MSI分析的进一步应用，包括跟踪患者对放疗的反应，检测宇航员从太空返回时暴露在辐射下的DNA损伤。他还在与南加州大学和威斯康辛大学的研究人员一起测试一组新的标记。

“这是我的假设，但我认为(错配修复)是一个累积的过程。在没有MMR的环境中，单核苷酸几乎总是会被删除。所以随着时间的推移，这应该会导致更大的尺寸变化，事实上，我们看到了。晚期癌症转移较大，而早期癌症转移较小。我们不太了解中间的情况，但我真的认为这是一种进步。”

例如，结肠息肉历来都不是MSI分析的好对象。息肉是癌前病变，所以即使有错配修复缺陷，它们可能也没有积累大的尺寸变化，所以很容易被发现。Jeff认为，一套新的长单核苷酸标记可以提供足够的灵敏度，即使在这些早期息肉中也能检测到MSI。到目前为止，他的研究结果表明他是正确的。

当被问及未来时，杰夫花了一点时间反思过去。

“我记得在90年代，我看过Rick Boland关于检测血液中MSI的论文。嗯，那只是一页的评论之类的东西。这不是很酷吗?这不是我的梦想吗?从血液样本中检测出癌症?当然，这仍然是梦想。但我想说，它越来越近了。”

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引用:

1. Ionov, Y.等人(1993)Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D， & Perucho M.在简单重复序列中普遍存在的体细胞突变揭示了结肠癌发生的一种新机制。自然杂志，363 558-61。(PubMed: 8505985)
   
2. Thibodeau, S. et al.(1993)微卫星不稳定性在近端结肠癌中的应用。科学260,816-9。(PubMed 8261393)
   
3. Aaltonen, A. et al.(1993)家族性结直肠癌发病机制的线索。科学260,812-6。(PubMed: 8484121)
   
4. Boland, R. et al.(1998)国家癌症研究所关于微卫星不稳定性对癌症检测和家族易感的研讨会:确定结直肠癌微卫星不稳定性的国际标准的制定。Cancer Res. 58, 5248-57。(PubMed: 9823339)
   
5. Suraweera, N. et al.(2002)使用五个准同构单核苷酸重复序列和五重PCR评价肿瘤微卫星不稳定性。消化病学，123,1804 -1811。(PubMed: 12454837)
   
6. Le, D. et . (2015) PD-1阻断在失配修复缺陷肿瘤中的作用。英国医学杂志37,2509-20。(PubMed: 26028255)

注:本文已于18年9月28日更新，以包含来自Promega以外科学家的额外贡献。