使用NanoDLR™双荧光素酶检测系统混合和匹配主报告和对照报告

正如在较老的DLR™和Dual-Glo®双荧光素酶检测中一样，在NanoDLR™检测中，萤火虫荧光素酶可作为测量生物反应的主要报告物，由NanoLuc®荧光素酶替代Renilla荧光素酶作为本构对照。在此分析格式中，可以使用萤火虫荧光素酶或萤火虫荧光素酶- pest (luc2P)作为实验报告。NanoLuc®蛋白具有高强度发光和稳定性Renilla荧光素酶。当在同等条件下的哺乳动物细胞中表达时，使用NanoDLR检测方法的NanoLuc®发光通常比纳米荧光试剂亮1000倍左右Renilla使用Dual-Glo®检测发光。因此，少量的对照质粒可以转染NanoLuc®荧光素酶，潜在地减少实验报告的转录抑制。如果灵敏度是控制的一个问题，NanoLuc®和NanoDLR™检测将提供最亮的信号。

为了获得最亮的信号和最大的响应，使用NanoLuc®-PEST荧光素酶作为实验报告，使用萤火虫荧光素酶作为本构控制。当在同等条件下的哺乳动物细胞中表达时，使用NanoDLR检测方法的NanoLuc®-PEST信号通常比使用Dual-Glo®检测方法的luc2-PEST信号亮十倍以上。由于其较短的细胞内蛋白质半衰期，NanoLuc®-PEST融合也将更快地响应，与萤火虫荧光素酶或luc2-PEST相比，通常具有更大的信号背景比。未融合NanoLuc®荧光素酶也可以用作实验报告，以最大化发光，但较长的蛋白质半衰期可以提供较慢的响应基因转录的变化和较低的信号-背景比与萤火虫荧光素酶，luc2-PEST或NanoLuc®- PEST相比。

NanoDLR™检测的灵敏度还支持将两种荧光素酶用作主要报告子的检测格式。NanoDLR™检测中对萤火虫荧光素酶的有效抑制，确保即使在luc2-PEST表达水平非常高的情况下，也可以检测到基础水平的NanoLuc®-PEST表达，而不会有信号渗漏的风险。这种分析格式可以增加从给定样品中获得的信息量。然而，在没有内部控制报告的情况下，重要的是实验设计要最小化细胞数量、转染效率、移液量等的可变性。反应最灵敏的报告者是pest -失稳形式的萤火虫和NanoLuc®荧光素酶。

Firefly Transcriptional Reporter Plus Protein Fusion to NanoLuc®Luciferase

nanollr™assay支持的一种检测格式是将萤火虫报告基因的转录读数耦合到与NanoLuc®荧光素酶融合的蛋白质的稳定性测量。例如，许多应激反应途径是由转录因子的动态蛋白质周转调节的。监测NanoLuc融合的发光是跟踪这一发生在转录和翻译上游的调控事件的简单方法。由于其亮度和体积小，NanoLuc®荧光素酶是作为蛋白质稳定性传感器的理想融合伙伴。亮度是至关重要的，因为它允许NanoLuc融合蛋白以比与其他荧光素酶融合低得多的浓度表达，即在更生理相关的水平上表达。因此，最相关的生物反应通常是通过相对较弱的启动子表达NanoLuc®融合蛋白，转染少量DNA，或将DNA稀释成无启动子的载体DNA(例如，转染载体DNA;猫。# E4881)。

一致性报告系统

由于化合物与报告酶的直接相互作用，使用报告基因测定的高通量筛选可以产生大量的非相关命中。通过使用符合报告系统，可以将真正调节感兴趣的生物途径的化合物与影响报告酶稳定性或活性的化合物区分开来，在该系统中，转录激活导致两个具有不同化合物干扰谱的同源报告酶的化学计量学表达(1)。由于各自底物的差异，Firefly和NanoLuc®荧光素酶是一对特别有吸引力的同源报告酶干扰化合物的低重叠(2)。

在符合报告系统中，萤火虫荧光素酶和NanoLuc®-PEST荧光素酶由同一个启动子表达，未融合的报告酶的化学计量量由病毒P2A肽序列介导的核糖体跳跃产生(3)。在将感兴趣的启动子插入luc2-2A-NlucP构建物后，使用NanoDLR™检测转录激活。增加转录的化合物会同时增加两个报告基因的活性，而影响一个报告基因稳定性或活性的化合物通常只对一个报告基因起作用。

从两个不同的报告器获得独立的读数可以提高信噪比，并增加对只对转录产生很小影响的撞击的信心。此外，由于NanoDLR检测™中的两个明亮的报告，符合系统与基因编辑技术兼容，允许检测内源性表达水平以进行更相关的筛选分析。

1. Cheng, K.C.和Inglese, J.(2012)用于高通量筛选的巧合报告基因系统。自然方法9, 937年。
2. Ho P。等．(2013)报告酶抑制剂研究，以帮助组装正交报告基因分析。ACS化学。医学杂志．8, 1009 - 17所示。
3. 哈森,S.A.等．(2015)使用基因组编辑的符合报告对内源性PARK2表达进行化学基因组分析。ACS化学。医学杂志。10 (5), 1188 - 97。