实时检测细胞凋亡

细胞层面的生命受两种相反力量的支配。大量的研究致力于细胞增殖——多种因素刺激细胞分裂和分化的多种复杂途径。相对而言，我们对细胞凋亡知之甚少，它是“程序性细胞死亡”的一种形式——细胞机制被触发自行关闭的自杀过程。

当这两种力量之间的微妙平衡被破坏时，有机体就会遭受病理后果，如癌症。细胞凋亡可由多种外部因素引起，从血清退出或DNA损伤到药物和毒素的作用。在体内，与凋亡相关的细胞变化包括起泡、细胞收缩、染色质凝结以及最终的核DNA降解。凋亡细胞外化生物标记物，触发免疫系统的清除。在实验室培养的细胞经历了类似的过程，但最终，细胞膜的完整性会随着细胞自身的分解而丧失。

细胞凋亡并不是细胞死亡的唯一机制。坏死是一个不依赖能量的过程，使用传统的组织学技术可以表现出类似于细胞凋亡的现象。所有细胞死亡过程都在一定程度上重叠，但可以通过依赖于每种机制所特有的特定细胞特征或生物分子的鉴定来区分它们。

细胞凋亡检测的新方法

研究细胞凋亡的最初尝试集中在质膜的变化，特别是磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)。在健康细胞中，PS分子活跃于质膜的胞质表面(内部)。当细胞发生凋亡时，被统称为翻转酶和超燃酶的酶介导PS“翻转”到膜的外(细胞外)侧，在那里它们作为巨噬细胞吞噬和破坏凋亡细胞的信号。

许多研究细胞凋亡的检测平台都是基于膜联蛋白V染色。膜联蛋白V是一种特异性与PS结合的蛋白。历史上，这些实验使用荧光标记的重组膜联蛋白V蛋白，它与正在发生凋亡的细胞表面的PS结合。在正常细胞中，没有膜联蛋白v的结合发生，因为标记的膜联蛋白v不能通过质膜。然而，在死亡(坏死)细胞中，膜联蛋白V也会与PS结合，因为膜的完整性丧失了。因此，一些检测使用二级标记方法，如DNA染色碘化丙啶或7-氨基放线菌素D，来区分凋亡细胞和坏死细胞。这种“双重标记”程序允许通过流式细胞术等方法分离和定量凋亡和坏死细胞。这种方法的缺点是DNA染色是有毒的，并且该方案是劳动密集型的，依赖于研究人员的定性判断，并且需要在设置数据收集参数和分析方面的专业知识。

一种新的均质检测方法提供了一种更简单的方法来实时监测细胞凋亡和坏死，使用发光膜联蛋白V方法结合荧光染料方法来替代传统的膜联蛋白V染色。RealTime-Glo™Annexin V凋亡和坏死分析通过重复记录同一细胞样本的发光和荧光，使用记录发光和荧光的微孔板阅读器，监测细胞凋亡和继发性坏死的动力学。

该检测试剂利用膜联蛋白V融合蛋白，被设计成含有二元NanoBiT®荧光素酶蛋白、荧光素酶底物、氯化钙和细胞不渗透的荧光DNA染料的不同互补亚基，用于检测坏死细胞。“与其他荧光dna染色染料不同，”Promega高级研究科学家Andrew Niles说，“坏死检测试剂对死细胞表现出高荧光，而对活细胞表现出低固有背景，并且具有高光稳定性，可以进行可靠的、实时的、基于平板的测量。”

Niles解释说，“添加-混合-测量”格式是可能的，因为发光信号只发生在二元annexin-NanoBiT蛋白与PS有效结合时。annexin-荧光素酶亚基对彼此只有适度的亲和力，因此，在活细胞存在时，发光仍然很低。当膜联蛋白V融合蛋白结合到暴露在凋亡细胞表面的紧密结合筏的PS分子时，融合对被引入到近距离。在这些条件下，荧光素酶亚基重组形成活性荧光素酶，产生发光。该方法使用了一种新型的、随时间释放的荧光素酶底物，能够监测PS暴露事件的动力学和强度。

Niles说，由于试剂直接添加到培养中的细胞中，该检测“提供了传统膜联蛋白试剂的所有基本功能，但可以在微孔板格式中进行，无需繁琐的洗涤或处理步骤。”因此，该检测方法可以扩展到高密度板格式，用于高通量筛选(HTS)实验——与标准流式细胞仪应用相比，这是一个显著的优势。此外，由于试剂是非溶性的，细胞保持完整，用于下游分析，如细胞活力测定或caspase 3/7测定。

曲妥珠单抗emtansine是fda批准的抗体药物偶联物(ADC)，临床上用于对抗乳腺癌。单克隆抗体靶向部分(曲妥珠单抗)结合到人表皮生长因子2 (HER2)受体，该受体在易感肿瘤细胞中过度表达，允许有毒负载(emtansine)进入细胞并破坏它们。下面的数据显示了RealTime-Glo™Annexin V凋亡和坏死检测如何用于检测模型系统中使用曲妥珠单抗emtansine处理的SKBR3 HER2+细胞的剂量和时间依赖性凋亡和继发性坏死，与未处理的对照组相比。在给药后52小时内，该试验提供了实时敏感的凋亡和坏死检测(图1)。

肿瘤坏死因子α (TNF-α)已广泛应用于模型系统，诱导培养细胞系凋亡。尽管TNF-α在不同类型的细胞中激活多种信号通路，但特别值得关注的是另一种细胞死亡途径，最终导致“坏死”——一种在生理学上不同于凋亡的程序性细胞死亡形式。坏死是一些疾病的特征性反应，特别是与炎症有关的疾病。RealTime-Glo™Annexin V凋亡和坏死检测提供了一种有用的方法，可以在使用TNF-α或TNF-α与caspase抑制剂处理的U937细胞中区分两种类型的细胞死亡机制——凋亡和坏死(图2)。包含坏死抑制剂(necrostatin-1)证明了坏死表型的可逆性，并证实了作用机制(图2,B组)。

总结

RealTime-Glo™Annexin V凋亡和坏死分析提供了一种使用多模板阅读器实时研究凋亡和继发坏死动力学的敏感方法。均匀的“无洗”试验可用于监测细胞对未知效力或作用机制的新型生物和化学试剂的反应。使用测定法收集的数据可以通过动态区分PS暴露和膜完整性损失之间的联系来区分不同的细胞死亡机制。

确认:我们感谢Promega科学家Andrew Niles和Kevin Kupcho为本文提供的数据，以及他们的评论和评论。