“这种药会引起肝毒性吗?”

Monika Kijanska博士的任务是开发和提供用于测试药物安全性和有效性的3D培养解决方案。她是肝脏解决方案的高级科学家和团队负责人InSphero该公司是一家生物技术公司，专门从事药物安全和有效性测试的3D细胞培养技术。

传统上，药物安全测试通常使用在培养皿中生长的二维培养物，即使它们不能准确地代表活体器官。最近，3D培养(也被称为球形和微生物组织)已经成为药物筛选和开发的体外模型的选择。有了3D显微组织技术，你可以共培养不同类型的细胞，并添加器官特定的细胞成分，以更好地模拟活器官的细胞组成。因此，3D文化的功能可以比2D模型保存更长的时间。这种长寿命对于确定潜在的药物性肝损伤(DILI)非常重要。某些化合物可能会在肝脏中产生慢性影响，这种影响只有在长时间接触后才会发生，而在代谢能力仅为几天的短期2D培养中可能会被忽略。

虽然3D培养有很多优点，但对于制药公司来说，为药物筛选目的开发可靠和统一的3D模型是一项缓慢和昂贵的任务。这是Kijanska医生和InSphero的肝脏团队可以提供服务和专业知识的地方。

“肝毒性是我们试图回答的主要问题之一。”

InSphero肝脏团队开发了3D InSight™人类肝脏微观组织模型，该模型是高度标准化和均匀的肝脏球形体，在特别设计的96孔板中培养。这些肝脏模型的主要特征是在培养28天内增强了代谢能力和稳定性。为了确定特定的化合物是否会导致长期的肝毒性，这些肝组织用化合物处理了14天，并在此期间多次重新给药。在暴露结束时，使用终点细胞活力测定法来确定总体活力。

为了评估药物是否会引起DILI，研究人员不仅需要知道治疗结束时存活细胞的数量，还需要了解细胞毒性效应的动力学。毒性是在什么具体时间和浓度发生的?使用传统的终点细胞毒性测定方法获得这些数据的唯一方法是在每个时间点分别建立肝脏微组织板。这大大增加了获得答案所需的成本和时间。

“为了解决大多数基于细胞的科学问题，你既需要一个模型，也需要一个实验。”

InSphero的团队开始寻找能够为3D InSight™肝组织提供精确端点数据的最佳细胞毒性测定方法。他们理想的细胞毒性试验将允许他们在14天的时间内监测细胞死亡。这将允许他们与其他化验进行多重分析，以一种经济有效的方式获得尽可能多的数据。它的灵敏度足以从单个微观组织中检测到细胞死亡。它可以在96口井或384口井的格式中扩展使用。最后，它将是快速和简单的运行。

“为了得到正确的答案，我们需要有一个合作伙伴来提供与我们的模型相匹配的分析。”

通过与Promega的科学家Jolanta Vidugiriene博士和Natasha Karassina博士的交流，InSphero的肝脏团队成为第一个测试基于LDH释放的新的细胞毒性测定方法的团队之一。他们的团队已经在使用完善的PromegaCellTiter-Glo®化验该技术可以检测ATP作为衡量细胞活力的标记，而且他们很喜欢它使用起来很容易。该方案包括在含有细胞的样品孔中加入试剂，短短10分钟的孵育和使用平板读数光度计直接测量。简单的“添加-混合-测量”过程是典型的Promega细胞分析，InSphero的团队想要类似的东西，他们可以用在他们的3D模型中测量细胞毒性。

“乳酸脱氢酶的释放与我们目前测试的细胞毒性化合物有很好的相关性。这真的有助于回答关于化合物潜在细胞毒性的问题。”

乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的酶，一旦细胞死亡时质膜被破坏，它会迅速从细胞中泄漏出来。多年来，LDH被广泛用作细胞死亡的标志，但有一个共同的问题。大多数现有的测定方法使用比色法或荧光法进行检测，它们往往不够灵敏，无法检测从单个球体释放的乳酸脱氢酶。

“我们只需要几微升的上清液进行LDH-Glo™检测。这是非常敏感的。”

新LDH-Glo™细胞毒性测定利用高灵敏度的生物发光来量化LDH的释放，从而可以精确检测少量细胞中LDH的释放。事实上，这种检测方法非常敏感，只需要少量的培养基就可以检测。这在处理仅由几千个细胞组成的单个3D微组织时尤其有价值。

“这是一个简单的实验。你只需要把上清和试剂混合，然后孵育和读出。这非常简单。”

LDH- glo™检测包括从样品孔中去除2-5µl的培养基，然后在存储缓冲液中稀释，以保留LDH活性。这使您可以灵活地立即测量乳酸脱氢酶的释放或将样品保存在-20°C，以便在不损失乳酸脱氢酶活性的情况下进行未来检测。当准备好检测时，只需将LDH检测试剂添加到采样介质中，并使用平板读数光度计测量发光信号。就是这样。

“我们可以从这种乳酸脱氢酶检测的单一实验中获得更多的数据。”

因为乳酸脱氢酶检测只需要几微升的培养基，所以可以在一段时间内从同一井中重复采样。样品也可以在介质变化期间进行。这样就不需要为每个时间点设置多个板块。今天，Kijanska博士使用LDH-Glo™测定法来确定在14天的多剂量期中发生细胞毒性反应的时间和浓度。在暴露结束时，他们仍然可以使用剩余的细胞和培养基进行其他端点测定，如细胞活力或细胞因子检测。

“最好的分析方法是帮助你回答你的研究问题。”

通过将细胞活力检测与LDH-Glo™检测配对，Kijanska博士可以得到比基于atp的细胞活力检测单独提供的更明确的答案。例如，当ATP水平下降时，可能是由于代谢压力或膜破裂。只有配合乳酸脱氢酶检测，你才能得到一个明确的答案:低ATP水平和高乳酸脱氢酶水平表明细胞膜破裂和坏死;低ATP水平和低LDH水平表明代谢应激。

“我们越来越多地将LDH-Glo™检测作为肝组织毒性检测的常规方法。我也认为它将与我们的其他微观组织模型很好地工作。”

LDH- glo™检测在3D InSight™肝脏组织中工作得非常好，部分原因是InSphero的专用培养基不含血清，因此背景LDH水平非常低。这可能不是其他3D球体模型的情况。尽管如此，Kijanska博士正在向InSphero的其他团队传播LDH-Glo™检测技术，他们希望该检测技术在InSphero的其他3D模型中也能很好地工作。她认为，他们的3D模型与LDH-Glo™检测相结合，是评估药物肝毒性作用的理想组合。

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