免疫原性细胞死亡:测量损伤相关分子模式(DAMPS)的方法

安德鲁·奈尔斯和凯文·库普乔著

摘要

在过去的50年里，细胞死亡的研究发生了许多有趣的转折。现在人们普遍认为，细胞死亡的机制对生物体有重大的全球性影响。因此，免疫原性细胞死亡(ICD)对先天和适应性免疫反应的影响最近得到了关注。损伤相关分子模式(DAMPs)是ICD过程中产生的特定生物分子信使，它介导了这一过程的进展和规模。因此，主动调节它们的存在对健康和疾病都有重要影响。

传统的测定DAMPs的方法提供了合理的信息价值，但实施起来费力和耗时。本文介绍两种新的生物发光分析方法(RealTime-Glo™细胞外ATP检测而且Lumit™HMGB1免疫分析)，它们完全均匀，可以在标准的光度测量平台上使用。总之，这些可靠和健壮的分析提供了一个方便的工作流程，以评估操作的实验策略在体外免疫细胞死亡反应。

简介

维持多细胞内稳态的部分原因是一系列精心安排的、程序化的细胞死亡机制。这些项目通常分为“耐药”或“免疫”两种模式。耐药型(也称为免疫沉默型)细胞凋亡)涉及成熟的内在或外在信号级联，导致caspase激活和细胞膜的不对称脂质重塑。一个关键的磷脂酰丝氨酸易位事件，从内膜表面到外膜表面，提供了必要的“吃我”信号，死亡细胞在膜完整性丧失之前被吞噬。这种形式的细胞死亡并不促进炎症，通常与发育和组织重塑过程中衰老、受损、多余或不必要的免疫细胞或其他细胞类型的有效清除有关。

炎症表现为免疫原性细胞死亡，可进一步分离为子例程，如坏死、焦亡、铁下垂、网状细胞病或一种不同形式的凋亡。不管具体的子程序是什么，damp暴露和/或释放到细胞外环境中，使免疫细胞浸润和随后的局部炎症持续。ICD是病毒和细菌攻击以及肿瘤特异性细胞毒性t细胞获得性发展的重要第一道防线。ICD也可以被破坏产生急性和慢性病理。

细胞外三磷酸腺苷(eATP)和高迁移率群盒B1 (HMGB1)蛋白是两个被认为对建立免疫原性细胞死亡表型重要的damp。尽管ATP主要被认为是一种通用的能量传输分子，但细胞外形式的ATP也参与细胞间各种信号传递事件。eATP通过在多种细胞类型上表达的P2嘌呤能受体介导这些作用。在ICD的情况下，来自死亡细胞的eATP为树突状细胞(抗原处理细胞)提供初始的化学引诱梯度，然后通过应答免疫细胞的旁分泌释放维持炎症事件。

HMGB1是一种主要的、染色质相关的非组蛋白，在细胞核内分隔。在ICD事件中，HMGB1转移到细胞质中，最终通过目前未描述的通道激活事件或死后膜完整性丧失后的被动释放释放到细胞外环境中。细胞外HMGB1以各种氧化还原状态存在，促进树突状细胞成熟和炎症事件的全面加剧。

虽然每个生物标志物单独对评估免疫原性细胞死亡事件的程度具有预测价值，但eATP和HMGB1的联合存在或缺失比单一参数测量提供了统计上更强的表型指标。因此，快速和容易地测量这两种生物标志物的能力是发现和开发与ICD调节相关的活动的关键。

测定免疫原性细胞死亡的常规方法

在ICD事件中，eATP和HMGB1以时间依赖性的方式释放到细胞外环境中。目前，细胞上清样本被定期收集，并经过一段时间的处理，即去除一定体积的培养基，并将其置于低速离心以去除细胞和/或细胞碎片。上清液通常放置在+4或-20°C，直到被询问特定分析物的水平。未能重复收集和处理上清，去除细胞或碎片，或适当地储存它们，会使eATP和HMGB1定量复杂化。

细胞外ATP最常用的量化方法是终点光度法。通过这种方法，含有过量荧光素酶和荧光素的反应混合物与含有未知水平的eATP的样品接触。的生物荧光反应产生与样品中的eATP成正比的光光子。然而，精确测量上清液中的eATP是一个特别巨大的挑战。例如，大多数转化细胞系的细胞膜atp酶(如CD39)表达增强，并在血清中繁殖和维持，血清中也含有显著的atp酶活性。在采样和处理过程中，这些外生酶活性使实验释放的eATP浓度处于特别的风险中，因为在几分钟内eATP水平急剧下降(图1)。

图1。细胞外ATP在细胞培养环境中不稳定。纯化的ATP (20nM)加入RPMI 1640，添加或不添加10%胎牛血清，放置在冰上。样品定期取出并在37°C下孵育24小时。在疗程结束时，使用CellTiter-Glo®发光细胞活力测定法测量所有样本的ATP。数据强调标准的上清收集策略在短时间内存在eATP大量衰减的风险。检测前的这种衰减可能大大低估了eATP水平。因此，需要在衰变之前实时测量eATP。

HMGB1水平通常用Western blot或ELISA检测。虽然西方分析提供了分析物释放的关键生化证据，但定量差，冗长且费力。酶联免疫吸附法也很繁琐和耗时，但提供了极高的灵敏度。不幸的是，ELISA格式的动态范围也很差。这种有限的动态范围要求样品在测试前稀释，使其落在测定的线性范围内。当样品的分析物水平未知时，样品必须在不同的稀释水平下运行整齐，增加要处理的样品数量。此外，至少有一个经过充分验证的商业供应商的检测方法可能成本高昂。

细胞外ATP和HMGB1测定方法的改进

我们开发了两种新的、不需要样品收集和处理的均质分析化学试剂，大大简化了ICD分析工作流程。您可以简单地创建各自的试剂，并将其交付到平行的实验样品培养井。的RealTime-Glo™细胞外ATP检测试剂中含有热稳定的Ultra-Glo®荧光素酶和化学纯荧光素，它们已被配制成与活细胞兼容(图2)。这些成分与生长培养基混合，并在时间“零”时添加到处理和未处理的细胞中，以检测eATP的释放随时间的变化(图3)。这些反应物经过仔细优化，具有实时耐受性，因此未处理细胞的固有生物学不受干扰，可以建立eATP释放的基线。除了新格式节省了大量时间和精力外，实时读数还提供了整个暴露过程中eATP水平的连续和实时报告。当使用动态模式的加热光度计在自动化格式中使用时，使用环境气体控制或CO₂通过最终的暴露时间点(图4)，检测变得真正“不受干涉”。

图2。生物荧光细胞外ATP检测化学。

图3。RealTime-Glo™细胞外ATP检测工作流程。

图4。刺激驱动的eATP释放是剂量和时间依赖性的。U937细胞在RealTime-Glo™细胞外ATP检测试剂存在的情况下，被连续稀释硼替佐米、阿霉素和罗哌啶肽给药。在照射过程中产生的eATP释放曲线在动力学上与剂量、时间和信号大小有关。这些差异将使任意端点eATP测定难以解释，而且可能不准确。

的Lumit™HMGB1免疫分析试剂可以在曝光完成时直接添加到测试孔中。该试剂包含一个荧光素酶底物和两个抗HMGB1单克隆抗体，这些抗体被偶联到合理分裂和重新进化的荧光素酶的互补元素(LgBiT或SmBiT)上(图5)。在没有HMGB1分析物的情况下，抗体偶联物在溶液中保持自由和不结合，只产生中等的发光信号。在HMGB1存在的情况下，抗体与它们的同源表位结合，促进LgBiT和SmBiT在抗原上的近端诱导互补。这些事件的结果是发光与分析物的量成正比。因此，化合物诱导icd的特性可以通过以下反应的效力和大小随时间的变化来描述(图6)。值得注意的是，在icd诱导释放事件后，可以使用未处理的细胞样本或使用Lumit™方法的上清液测量HMGB1抗原的检测。两种样品类型都与现有的ELISA方法具有良好的相关性(图7)。此外，从实验中得到的诱导和非诱导值可以与试剂盒中提供的重组人HMGB1的标准曲线进行比较。更多的实验已经证明了与小鼠HMGB1亚型的显著交叉反应性，允许在类似的诱导系统中进行分析。

图5。Lumit™HMGB1免疫分析概念和工作流程。

图6。HMGB1的释放与剂量和时间有关。U937细胞在复合暴露6、12、14和22小时的时间过程中被连续稀释硼替佐米。在终点处加入Lumit™HMGB1免疫分析试剂，收集发光数据。硼替佐米在大约6小时时开始启动HMGB1释放，并在整个22小时的疗程中继续影响额外的释放。在该模型中，HMGB1的释放随时间增加而增加，但HMGB1在长时间暴露中容易丧失抗原性。因此，对于潜在或效力未知的化合物，通常指示24和48小时的暴露。

图7。Lumit™HMGB1免疫分析法与商业ELISA供应商的性能比较。U937细胞分别给药硼替佐米或阿霉素24小时。在曝光完成时，从平板的平行孔中制备无细胞上清。将Lumit™HMGB1免疫分析试剂添加到含有处理过的细胞或收集的上清液的孔中。上清液(和上清液的稀释)也用商用HMGB1酶联免疫吸附测定法进行测定。两种样本格式显示出与商业ELISA方法异常一致，收集结果所需时间大大缩短(Lumit™HMGB1免疫分析法为1.5小时，ELISA法为25.5小时)。

方法使用ICD工具化合物和模型细胞系进行验证

的RealTime-Glo®细胞外ATP检测而且Lumit™HMGB1免疫分析设计用于体外ICD发现和表征工作。因此，我们使用各种人(图8)和小鼠(图9)悬浮液和依赖于吸附的细胞系，用一系列稀释的阻尼诱导工具化合物进行验证。ATP释放实验的数据是使用配备了大气控制的BMG CLARIOstar™或使用二氧化碳无关介质的CLARIOstar™实时收集的。实时eATP数据和Lumit™HMGB1数据收集使用GloMax®发现．

图8。人类细胞系的双重湿度测量。U937细胞在平行平板上连续稀释米托蒽醌。将RealTime-Glo™细胞外ATP检测试剂添加到一个培养皿中，在co2无关的培养皿中添加10% FBS，并使用GloMax®Discover在24小时内收集信号。第二个平板孵育24小时，然后直接与Lumit™HMGB1免疫分析试剂接触。使用GloMax™Discover收集发光。前面板:米托蒽醌可产生剂量和时间依赖性的eATP释放，随着时间的推移，其效力逐渐增加。底部面板:重组人HMGB1抗原在1ng ~ 729ng/ml范围内产生线性反应。米托蒽醌诱导的HMGB1释放事件的剂量依赖，其效力与eATP一致。

图9。小鼠细胞系的双重湿度测量。EL4细胞被连续稀释的去甲柔红霉素置于平行平板中。将RealTime-Glo™细胞外ATP检测试剂添加到一个平板中，在co2无关的10% HS培养基中，使用GloMax®Discover暴露24小时后收集信号。第二个平板孵育24小时，然后直接与Lumit™HMGB1免疫分析试剂接触。使用GloMax™Discover收集发光。前面板:伊达柔比星产生剂量和时间依赖性的eATP释放，在一段时间内只产生适度的效力增加。底部面板:重组小鼠HMGB1抗原在3ng到2187ng /ml之间产生线性反应。与eATP相比，去甲柔比星诱发的HMGB1释放事件的剂量依赖性要强得多。