荧光素酶报告基因分析用于解析GPCR通路

GPCRs的主要功能是通过与异三聚体G蛋白的胞内偶联跨质膜传递胞外信号。此外，新出现的证据表明GPCRs可以独立于G蛋白发出信号。异三聚体G蛋白根据其Gα亚基分为四个亚家族_年代G_我G_问和G₁₂．GPCRs激活后，Gα蛋白亚基与βγ-二聚体亚基分离，启动下游第二信使通路的级联，最终通过各种反应元件(RE)诱导基因转录，包括cAMP反应元件(CRE)、活化t细胞反应元件的核因子(NFAT-RE)、血清反应元件(SRE)和血清反应因子反应元件(SRF-RE)(图1)。

许多GPCRs的G蛋白偶联谱尚未完全确定。一些GPCRs只与一种类型的G蛋白偶联(如G_年代或G_我)，但许多GPCRs偶联到广泛的G蛋白家族，如G_我/ G₁₂G_问/ G₁₂，或G_我/ G_问/ G₁₂(1)。目前在GPCR筛选程序中采用的方法通过测定第二信使如cAMP、三磷酸肌醇(IP3)和细胞内Ca的变化来测量G蛋白信号^{2 +}动员，这通常需要建立不同的分析平台，并需要针对每种途径的专门仪器，而且可能成本高昂。报告基因分析为研究和表征受体/G蛋白偶联提供了一个简单的解决方案，因为具有特定响应元件的报告载体(CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE)可用于G_年代G_我G_问和G₁₂路径(图1)。

报告基因系统被广泛用于研究GPCRs对基因调控的响应。报告基因有碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、绿色荧光蛋白和荧光素酶等。其中，荧光素酶因其敏感性、广泛的动态范围、缺乏内源性活性和固有的低化合物文库干扰而成为高通量筛选的首选报告因子(2)。含有最小启动子和快速反应™荧光素酶的pGL4载体已被证明可以提高cAMP响应元件对G的响应性_年代耦合的受体。我们进一步构建了不同pGL4载体的SRE和SRF-RE报告基因，并在HEK293细胞中瞬时表达。通过在荧光素酶c端添加蛋白降解序列hPEST和hCL，与没有降解信号的传统荧光素酶相比，SRE-和SRF-RE报告子均具有更大的诱导反应(75- 120倍)，基础活性较低(图2)。此外，失稳荧光素酶反应迅速，在4-6小时内达到最大诱导。

pGL4.33 [luc2P/SRE/Hygro]矢量和pGL4.34[luc2P载体分别含有SRE和SRF-RE，位于最小启动子和快速反应™荧光素酶上游。已知SRE响应三元复合因子(TCF)依赖的MAP激酶途径，而SRF-RE是一种缺乏TCF结合域的SRE突变形式，被设计用于响应srf依赖和TCF不依赖的途径，如RhoA激活。GPCRs，特别是与Gi和Gq偶联的GPCRs可以激活MAPK通路，诱导SRE的转录激活₁₂已知Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(rhogef)家族可以激活，从而激活RhoA和SRF-RE的转录激活(3)。

瞬时转染pGL4.33和pGL4.34报告载体的HEK293细胞在GPCR激活后荧光素酶的表达有很大的动态范围(图3)_问-偶联)和SRE报告在各种激动剂治疗6小时后显示50倍诱导。在激动剂中，毒蕈碱氯是最有效的，有一个EC₅₀19nM，其次是卡巴醇，然后是匹罗卡品。在卡巴科尔存在的情况下测试了两种拮抗剂:东莨菪碱与IC₅₀0.07nM的浓度比吡仁zipine更有效。同样，SRF-RE与血栓素A2受体(G₁₂-耦合)显示了激动剂(120倍诱导)和拮抗剂的剂量-反应曲线。激动剂的效价排名为I-BOP (EC₅₀=0.16nM) > U46619 = U44069，拮抗剂为BM-531 > SQ-29548。其效价排序与之前的报道一致，表明荧光素酶报告子实验的结果反映了生物学相关条件(4-5)。

Z´因子是在药物发现的高通量筛选中用于评估分析性能的主要统计参数。Z´因子确定为:Z´= 1 - [(3 × SD高+ 3 × SD低)/(平均高-平均低)]。Z´因子越接近1，检测质量越好。一般来说，> - 0.5的HTS值是可以接受的。选择4种GPCRs: D1多巴胺受体、m4毒蕈碱受体、m3毒蕈碱受体和内源性EDG受体。已知它们都与G结合_年代G_我G_问和G₁₂与相应报告载体在HEK293细胞中稳定共表达(CRE和NFAT-RE)或瞬时共表达(SRE和SRF-RE)。然后用激动剂刺激细胞，并确定Z´-因子值来评估测定性能(图4)。在384孔板格式中，所有测定均显示Z´-因子值显著高于0.5，响应动态(折叠诱导)范围为11- 366倍。

GPCRs可以在一种细胞类型中与多个G蛋白偶联，也可以以细胞类型依赖的方式与不同的G蛋白偶联。此外，越来越多的证据表明，同一受体可以根据配体的不同，以不同的强度激活多个信号通路，这些配体通过正构或变构方式与受体结合(6)。这对于开发通路特异性药物具有很大的潜力，这些药物可以提高疗效，减少副作用，并为化合物筛选增加另一个检测复杂性。尽管有很大的兴趣，但在目前的药物筛选实践中，包括受体/ g蛋白分析的进展缓慢，部分原因是建立多个分析平台的巨大负担。

荧光素酶报告法简单，灵敏，易于建立。更重要的是，它可以测量G_年代G_我G_问和G₁₂途径在单一的分析格式，因此是非常适合药理学研究。例如，已知m3毒蕈碱受体与G_问和G₁₂多种细胞类型的通路。当与单个报告载体共表达时，激动剂卡波酚激活m3毒蕈碱受体时，不同强度的响应元素CRE、NFAT-RE、SRE和SRF-RE诱导荧光素酶的剂量依赖表达(图5)。如表1所示，NFAT-RE和SRE报告载体测定显示出相似的EC₅₀受体激活值，证实m3毒蕈碱受体激活导致细胞内钙浓度增加和MAP激酶激活;两者都是由G介导的_问蛋白质。欧共体₅₀SRF-RE报告试验值与SRE和NFAT-RE报告试验值在同一对数范围内，表明m3毒蕈碱受体与G₁₂蛋白质和G_问．相比之下，电子商务₅₀CRE报告试验的值比其他报告试验的值高近3个对数，这与先前的报道一致，m3毒蕈碱受体与G_年代(7).所有EC₅₀通过m3毒蕈碱受体报告分析，不同信号通路的值显示出与使用其他检测技术相似或更好的敏感性(表1)。因此，荧光素酶报告技术能够以单一的检测格式研究g蛋白激活谱。

在这里，我们已经证明了快速反应™荧光素酶报告器非常适合研究GPCR信号通路和药物发现中的高通量筛选。GPCR调节剂可以很容易地评估其作为激动剂或拮抗剂的效力，结果反映了生物学相关的条件。荧光素酶报告分析很容易应用于高Z´因子值的高通量筛选。在单一检测格式中，单个GPCR途径(G_年代G_我G_问和G₁₂)可分别使用CRE-、NFAT、SRE-和SRF-RE报告载体测定法测定。

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