Lumit™细胞因子测定:用GloMax®Discover插值数据

四参数物流非线性回归分析(4PL)通常用于从ELISA标准曲线插值。4PL优化了s型剂量响应，非线性回归估计了高低渐近线、斜率和拐点。由于抗体结合的固有特性，完全滴定法的免疫分析，从零到目标蛋白显著过量，将产生s型剂量反应。然而，在实践中，估计非常高和非常低的浓度是不精确的，因为曲线在末端变平，并在这些区域引入了重大误差。此外，在低端，可变的背景信号会掩盖检测信号。这些精度约束要求从s型曲线的最线性部分开发校准曲线，避免高渐近线和低渐近线。事实上，商业elisa通常遵循这个处方。顺理成章，赫尔曼等．(2008)质疑4PL是否是ELISA插值的理想方法。他们分析了几种elisa，得出结论4PL对典型ELISA的曲线拟合并不理想，典型ELISA校准曲线的形状用二次或三次多项式拟合更好(2^nd或3^{理查德·道金斯}多项式非线性回归。

为了评估插入Lumit™细胞因子免疫分析数据的最佳方法，我们使用GloMax®Discover Microplate Reader比较方法为Lumit™il - 1β免疫测定．GloMax®Discover具有内置的非线性回归程序，可以快速插值未知数据，而无需使用商业程序传输数据和分析。插值的浓度可以方便地直接显示在与rlu相同的图像上。可以针对特定的校准曲线和特定的插补方法设置模板，显著提高效率。

Lumit™细胞因子免疫测定法具有非常宽的动态范围，校准曲线涵盖了> 3个细胞因子浓度的日志。相比之下，大多数ELISA标准曲线在< 2 log时延伸(图1)。对于两种分析类型，校准曲线都包含了如上所述的s型曲线的大部分线性部分。对数刻度显示了Lumit™IL-1β(小鼠)免疫分析法和典型ELISA的动态范围比较，直线方程说明了校准曲线的近似线性范围(图1)。

图1。Lumit™或ELISA小鼠IL-1β的校准标准(图A)和对数-对数图(图B)。试验的动态范围被记录和功率线方程显示在对数-对数尺度上。红色圈出的幂项表示斜率，值为1表示线性图。两个测定值都略< 1，表明s型曲线的线性范围接近，但在整个范围内不完全线性。

我们使用Lumit™IL-1β(小鼠)免疫分析法演示了GloMax®Discover上的插值方法。鼠标J774A。使用NLRP3抑制剂MCC950检测巨噬细胞对IL-1β释放的抑制作用。细胞用LPS (500ng/ml)处理过夜或不处理。第二天，在细胞中加入滴定量的MCC950，然后用奈革霉素(10 μ M)处理2小时。阴性对照细胞仅用lps启动(不使用奈革霉素)或仅用奈革霉素处理(不使用奈革霉素)。阳性对照细胞用lps诱变过夜，然后在没有MCC950抑制剂的情况下用奈尼霉素孵育2小时。RLUs表明，LPS诱导和尼日霉素处理的细胞显著释放IL-1β，而这种释放被MCC950完全抑制(图2)。

图2。使用Lumit™IL-1β(小鼠)免疫分析法发现MCC950抑制IL-1β释放的结果。J774A.1(5×10⁴在第4-11列96孔板(100µl/孔)中镀上lps引物或不引物(如图所示)。标准曲线井、无单元控制井和各种控制措施都得到了注意。隔夜引液后，取出50µl/孔培养基，加入25µl的4X MCC950滴定剂或对照剂，然后加入25µl的4X奈日霉素(10µM终液)孵育2h。显示了A-F行中MCC950的最终浓度，并注意到有/没有尼日霉素的孔。G行显示LPS +奈日菌素，但没有MCC950; H行显示LPS(列4-9)和奈日菌素(列10-11)，但没有MCC950。在奈革霉素处理后，取出50µl的培养基(用于另一项试验)，在所有孔中加入50µl 2X Lumit™抗体，孵育1小时，然后加入25µl Lumit™检测试剂。发光结果显示在彩色热图中，其中红色的井表示最高信号，深蓝色的井表示最低信号(图a)。MCC950抑制曲线在GloMax®Discover软件中绘制。

*表示一个值不一致的复制。

GloMax®Discover中包含插值程序，消除了数据传输的需要。插入的值直接出现在板块图中rlu的下方。可以在记录发光之前设置模板，也可以稍后进行分析。

基本步骤是:

1. 点击“分析”。
2. 在正确的孔中输入已知的细胞因子标准量。
3. 标记未知的井。
4. 从菜单中选择插值程序。
5. 保存模板或运行分析程序。

图3。GloMax®Discover分析软件截图。用Lumit™小鼠IL-1β校准浓度在前两列和剩余的平板孔作为未知数的平板布局示例。当分析运行时，插值的浓度直接显示在rlu的下方。

GloMax®Discover非线性回归程序4PL, 2^nd多项式,3^{理查德·道金斯}比较多项式，以确定标准曲线的最佳拟合，并为图2所示的结果插值未知数。三种方法的非线性回归曲线显示最适合的是2^nd多项式(二次;图4)。对数-对数尺度清楚地表明，第3个多项式和第4PL对标准曲线没有表现出理想的拟合，缺少标准曲线的最低两点。每种方法的未知数插值值证实了2的适当性^nd多项式线性回归插值(图5A)。4PL方法没有对校准曲线低端的rlu产生插值值，而3^{理查德·道金斯}多项式方法的结果是在标准曲线的低端rlu的负插值值。2^nd多项式方法可以在抑制曲线的整个范围内得到精确的插值值(图5A)。三种方法对MCC950抑制曲线给出了相似的IL-1β数量，适合插值，但对比表明，校正曲线拟合改善了2^nd多项式插值法(图5B)。

图4。GloMax®发现2^nd多项式,3^{理查德·道金斯}对Lumit™小鼠IL-1β校准标准进行4PL非线性回归曲线拟合。2^nd多项式非线性回归曲线较好地拟合整条校正曲线。

图5。GloMax®发现插值结果。比较2^nd多项式,3^{理查德·道金斯}插值IL-1β浓度的多项式和4PL非线性回归方法显示了插值浓度的细微差异(图A)^nd多项式法(图B)。每个点代表四次重复的平均值。mc950的IC50s计算为97nM(第2次多项式)，98nM (3^{理查德·道金斯}多项式)和142nM的4PL。

每种测定法的动态范围对比较也很重要。以图5为例，细胞分泌的IL-1β的所有浓度都在Lumit™免疫分析的范围内。用低浓度MCC950抑制剂处理过的细胞分泌的高浓度IL-1β超出了ELISA检测的范围(图1)。这意味着样品需要稀释到ELISA检测的范围内，需要进行第二次检测，或将稀释后的样品添加到原始检测中。因此，Lumit™免疫分析法的广阔动态范围节省了研究人员在实验室的时间。

动态范围广Lumit™细胞因子免疫测定可以直接测量释放的细胞因子，而不必稀释样品。当滴定诱导剂或抑制剂时，无需稀释不同浓度的测试剂以确保值在标准曲线范围内，就可以获得更多的数据。

对于lps启动的J774A。1细胞经奈革霉素处理后，IL-1β释放量从5 × 10⁴细胞/孔导致的浓度会超出ELISA标准曲线范围(见图1)，这使得检测设置复杂化，因为MCC950浓度较低的孔需要稀释到ELISA动态范围内。Lumit™免疫分析能够定量释放IL-1β从非常广泛的MCC950抑制剂范围10 μ M至5pM，而无需稀释任何样本(图5)。广泛的动态范围捕获了未受抑制细胞中IL-1β的最高水平，而敏感性检测到几乎完全受抑制细胞中IL-1β的最低水平。

不同非线性回归曲线拟合和插值方法的比较表明，2^nd与4PL和3相比，多项式方法更适合于Lumit™IL-1β(小鼠)免疫分析的宽校准曲线^{理查德·道金斯}多项式，同理，2^nd与其他两种方法相比，多项式方法能够更好地插值整个动态范围内的值。ic50与2例相似^nd和3^{理查德·道金斯}分别为97和98nM的多项式，但与4PL计算的IC不同₅₀142海里。4PL插值的局限性将表明更高的IC₅₀是不准确的。

GloMax®Discover系统可以通过内置程序非常快速地插值未知细胞因子浓度，并方便地显示插值值与RLU值相同。简单的分析设置还可以快速比较不同的非线性回归曲线拟合和插值方法，以快速确定最佳方法。符合赫尔曼等．(2008)，这些结果表明，校正曲线拟合和插值的多项式方法非常适合于Lumit™IL-1β(小鼠)免疫分析。