通过检测多路复用研究基因报告数据
马克·布拉茨，布拉德·胡克和特丽斯塔·沙加特
Promega公司
出版日期:2012年11月
摘要
遗传报告分析使研究人员能够研究细胞系统中由各种途径决定的转录的激活和抑制。激活和抑制细胞通路的化合物在现代科学研究中非常重要。报告基因检测是通过引入具有易于检测的报告基因表达的通路特异性序列的DNA结构来实现的。通常，这是一个荧光素酶基因，如果途径是活跃的将被表达。如果除非引入抑制剂，否则该途径始终是活跃的，那么荧光素酶也将构成型表达。这些报告水平的变化可以与通路激活的变化相关联。具有细胞毒性的化合物对报告分析提出了挑战，因为发光信号的减少可能只是活细胞数量的减少。因此，存在各种标准化方法，如Dual-Glo®荧光素酶检测系统和ONE-Glo™+ Tox荧光素酶报告和细胞活力检测，以防止数据误解。在本报告中，我们描述了CellTox™绿色细胞毒性试验是如何测试其作为报告分析的多路复用候选的潜力的。的集成电路50多重分析得到的值与IC无显著差异50仅使用报告分析格式获得的值，以及假报告信号减少，由生存能力的反向和谐变化显示。
简介
CellTox™绿色细胞毒性检测通过检测膜完整性的变化来监测细胞健康。该方法使用DNA结合染料，这种染料不能从细胞膜完好的细胞中分离出来(图1)。如果细胞膜受损，染料可以与死亡细胞的DNA结合。DNA结合可显著增加染料的荧光特性，荧光与细胞毒性成正比。该染料在生长培养中具有良好的耐受性，可直接稀释到培养基中，并在电镀或复合剂量时直接添加到细胞培养中。这种“无步骤”的方法允许研究人员在整个实验过程中监测细胞的健康状况。或者，CellTox™绿色染料可以在化合物暴露后以端点格式添加。因为这种检测方法是基于不同的膜渗透性和DNA染色，它不依赖于基于活性的生物标志物。如果在存在最大数量的生物标志物时不进行细胞毒性试验，基于活性的标记物往往会在细胞毒性事件后降解，导致信号丢失。DNA是一种更稳定的生物标志物，能产生持久的信号。
图1。CellTox™绿色细胞毒性检测。CellTox™绿色染料从活细胞中排除，但与膜完整性受损的死细胞的DNA结合。
多路复用是一种方便有效的方法，可以最大限度地收集数据量，并可以提高数据内容，同时减少所需的实验数量(1)。特别是，多路复用细胞毒性分析与报告试验是非常有利的。报告分析允许研究人员调查基因调控的广泛领域(2)。有许多不同的工具用于研究多种不同的调控途径。将这些基因调控实验与细胞毒性实验相结合，可以让研究人员验证发光信号的变化是否源于遗传途径的变化或细胞毒性事件。多路复用已被证明可以消除实验数据的错误解释。在本报告中，我们展示了CellTox™绿色细胞毒性分析可以与许多荧光素酶报告分析相结合，以改善数据解释。
方法
所需的材料
- CellTox™绿色细胞毒性试验# G8741
- 多模式平板阅读器，如GloMax®-Detection System, Cat。# GM3000
- CellTox™绿色细胞毒性试验# G8741
- ONE-Glo™荧光素酶检测系统# E6110
- Bright-Glo™荧光素酶检测系统# E2610
- Steady-Glo®荧光素酶检测系统# E2510
- Nano-Glo®荧光素酶检测系统，型号#N1110
- Renilla-Glo™荧光素酶检测系统# E2710
- 无核酸酶水，猫。# P1193
- 稳定转染具有组成型CMV-Firefly荧光素酶生产的HEK293细胞
- 稳定转染了组成型CMV-的HEK293细胞Renilla荧光素酶生产
- 稳定转染HEK293细胞的组成型CMV-NanoLuc™荧光素酶生产
- 用组成型CMV-NanoLuc™-PEST荧光素酶产物稳定转染HEK293细胞
- 特非那定，西格玛猫。# T9652-5G
- 离子霉素钙盐链霉菌属conglobatus西格玛猫。# I0634-1MG
CellTox™绿色细胞毒性试验与荧光素酶报告试验的多重评估
将组成性表达各种荧光素酶报告细胞的HEK-293细胞，以5000个/孔的速度，用50μl DMEM在96孔板的内孔中镀去边缘效应。在细胞中加入DMEM稀释的化合物50μl。细胞和化合物在37°C + 5% CO中孵育25-6小时。以不含CellTox™Green的培养皿作为对照，测定添加CellTox™Green的潜在有害影响。CellTox™Green采用两种方案进行测试:一种是“无步骤”方案，每500μl复合稀释剂中加入4μl，另一种是终点方案，将20μl CellTox™Green用2ml化验缓冲液稀释，然后将20μl稀释剂添加到细胞中。终点板在室温下孵育15分钟，以允许与释放的DNA相互作用。终点数据与“无步骤”协议数据相似，在此不作报告。在“-Glo”试剂加入到反应中之前，通过测量荧光来确定细胞毒性。然后将各自的“-Glo”试剂添加到孔中，并在室温下培养技术手册中建议的时间。孵育后，测定其发光性能。
结果
为了研究多路复用CellTox™Green与Promega提供的报告分析组合的适用性，由于化合物特非那定(200μM至0.78μM)具有已知的细胞毒性作用，因此选择了它。表1和图2显示了与CellTox™Green Assay混合的所有报告分析的结果。两组间无显著性差异50CellTox™绿色染料存在或不存在时测定的数值。由于CellTox™Green的引入，整体发光信号略有下降。这些数据中一个有趣的点是NanoLuc®荧光素酶对特非那定的反应。NanoLuc®发光信号不会像其他荧光素酶报告器产生的信号那样减少。当细胞被杀死时，NanoLuc-PEST™荧光素酶的发光信号下降得更明显。我们认为，信号折叠变化的减少是由于NanoLuc®荧光素酶的稳定性。这种进化的荧光素酶蛋白在细胞外更稳定(3)。因此，一旦细胞被杀死，NanoLuc®荧光素酶将在细胞培养基中保持活性，减少观察到的荧光素酶信号损失。这一现象说明了为您的实验系统仔细选择合适的荧光素酶报告剂的重要性。
表1。的集成电路50报告分析的值在CellTox™绿色染料存在或不存在时没有显著差异．该表显示了使用GraphPad Prism®5软件计算的细胞毒药物特非那定的统计95%置信区间。这些计算是基于六次重复。的集成电路50报告分析的值在CellTox™绿色染料存在或不存在时没有显著差异。该表显示了使用GraphPad Prism®5软件计算的细胞毒药物特非那定的统计95%置信区间。这些计算是基于六次重复。
细胞表达Renilla荧光素酶的发光曲线明显下降，荧光曲线相应急剧上升。为了测试这是否只是对这种特定细胞系的复合效应，研究人员用离子霉素代替特非那定来治疗这些细胞。离子霉素从100μM稀释到0.02μM，稀释3倍。从图3可以看出，离子霉素实验中没有出现异常曲线，但IC50值仍然没有显著差异。多重数据显示，细胞毒性事件可以降低报告信号，因此，细胞毒性测定(如CellTox™Green)对于正确的数据解释至关重要。
图2。用特非那定化合物完成的荧光和发光数据图表。
这些图表显示了CellTox™绿色细胞毒性试验(荧光，RFU)和荧光素酶报告试验(发光，RLU)的多重性所预期的反向一致性。发光信号随着细胞死亡和产生的蛋白质减少而下降。当细胞膜受损时，荧光信号升高，使CellTox™绿色染料与DNA结合。面板A、B和C是Bright-Glo™、Steady-Glo®和ONE-Glo™测定法，对产生萤火虫荧光素酶的HEK293细胞进行组成性测定;面板D是Renilla-Glo™检测HEK293细胞Renilla荧光素酶结构上;图E和F是在HEK293细胞上进行的Nano-Glo实验，如所示，这些细胞可以组成式地产生NanoLuc™荧光素酶或NanoLuc™-PEST荧光素酶。数据为6次重复的平均值和标准差。
图3。集成电路50离子霉素的数值。
发光数据与荧光数据再次呈现逆一致。由于分析的多重性，发光性降低，但IC50数值没有显著差异。集成电路50使用GraphPad Prism®5软件在6次重复中计算得出的值为95%置信区间。
总结
总之，这里提供的数据表明，CellTox™绿色细胞毒性试验可与荧光素酶报告试验兼容。虽然与CellTox™Green复用时观察到发光值的适度降低，很可能是由于荧光染料对发光信号的适度吸收，但这种信号降低不会影响分析生成的IC50值。发光信号平均比未添加CellTox™绿色染料低15.9%。在剂量或电镀(“无步骤”协议)添加CellTox™绿色染料的能力使研究人员能够在整个实验中监测细胞毒性，提供有关细胞健康的有价值的数据，并允许更成功地解释报告分析数据。
参考文献
- 胡珀，K. (2011)基于细胞的多重分析:获得更多生物学相关数据。Promega PubHub。
- Allard, S.T.M.和Kopish, K. (2008)荧光素酶报告分析:细胞生物学研究的强大，适应性强的工具。细胞的笔记21, 23-6。
- 大厅,议员et al。(2012)利用新型咪唑吡嗪酮底物从深海虾中提取的荧光素酶报告基因。ACS化学。医学杂志。7, 1848 - 57。
