使用NanoLuc®荧光素酶测量细胞内蛋白质寿命动态

传统的报告基因分析已被证明是询问适应性应激反应信号机制的强大工具。转录反应发生在远端信号终点，报告基因分析成功地将许多信号机制整合到单个细胞输出。这为测量细胞对小分子调节剂的整体反应提供了一种方便的方法。然而，药物作用通常发生在基因激活远上游的信号事件。因此，在药物发现过程中使用报告基因分析来阐明抑制剂的分子靶点是具有挑战性的，特别是在高度复杂的途径中。此外，转录读出对实时通路分析的效用有限，通常需要延长药物治疗时间才能获得足够的性能。因此，测量上游通路节点信号响应的替代方法是对转录报告器的理想补充。

应激反应通路使用一种常见的结构，包括蛋白质周转的动态调节，这允许考虑这种替代方法。例如，缺氧诱导因子- 1a (HIF1A)途径受到泛素-蛋白体系统的强烈调控(图1)。在常氧条件下，转录因子HIF1A被脯氨酰基羟基化和vhl定向泛素化抑制。泛素化的HIF1A注定会发生蛋白体降解，导致HIF1A蛋白水平低，HIF1A响应基因的基础转录水平低。当转入缺氧条件或HIF1A脯氨酰羟基化的化学抑制时，HIF1A蛋白从泛素/蛋白酶体途径解耦并在细胞核中积累。反过来，各种hif1a反应基因的转激活发生，导致细胞对缺氧应激的反应。HIF1A信号的小分子调控可能被证明在治疗癌症或缺血性疾病方面很有前途，这强调了在药物研发过程中测量HIF1A稳定性的定量方法的价值。

氧化应激反应途径同样受到蛋白质寿命的调节(表1)。在未受干扰的细胞中，核因子(红系衍生的2)-类2 (NRF2)受keap1导向的泛素化和蛋白染色体降解。活性氧破坏Keap1和NRF2之间的相互作用，导致NRF2积累和转激活。NRF2靶基因负责清除活性氧，并恢复细胞内稳态。虽然HIF1A和NRF2机制是蛋白质寿命在基因激活调节中的相关性的关键例子，但该通路结构在许多信号通路中是保守的，如表1(1)所示。因此，蛋白质寿命有潜力被广泛利用，作为适应性应激反应通路中关键上游信号节点的读数。

由于其体积小(19kDa)和强烈的生物发光输出(图2)，NanoLuc®荧光素酶非常适合作为蛋白质功能报告器，用于定量蛋白质寿命动态。细胞内蛋白水平的变化可以用Nano-Glo®试剂以简化的检测格式进行量化，其中NanoLuc®荧光素酶的发光输出被用作融合蛋白的细胞内水平的替代品。通过将NanoLuc®荧光素酶与HIF1A或NRF2蛋白直接基因融合，可以测量HCT116结直肠癌细胞中的缺氧或氧化应激反应信号(分别)。使用本构(如CMV)启动子驱动HIF1A-NanoLuc®或NRF2-NanoLuc®，光输出的变化与蛋白质水平的动态变化相关。然而，使用健壮的启动子，如CMV可能导致细胞内感兴趣的蛋白质水平非自然地高，产生潜在的检测伪象。

为了解决这一潜在的问题，编码NanoLuc®荧光素酶基因融合的质粒DNA被连续稀释到无启动子转染载体DNA中，以更好地接近感兴趣蛋白的生理相关表达水平。为了解决这一需求，Promega提供转染载体DNA (Cat。# E4881)，有资格用于哺乳动物转染实验。此外，编码NanoLuc®荧光素酶融合到PEST失稳域(NlucP)的控制载体pNL3.2 [CMV]可作为对NanoLuc®信号的非特异性影响的阴性对照。这些非特异性的影响可能是由毒性化学损伤或引入细胞的非特异性蛋白酶体抑制剂引起的。

如图3所示，当HCT116细胞瞬时转染1:10 00稀释的HIF1A-NanoLuc®质粒DNA时，1,10 -菲罗啉(一种已知的缺氧模拟物)诱导报告融合的剂量和时间依赖性积累。同样，在使用D, l -萝卜硫素(一种已知的活性氧诱导性物质)处理HCT116细胞后，NRF2-NanoLuc融合蛋白积累。为了确保NRF2-NanoLuc®水平在未受干扰条件下的适当调节，细胞被共转染KEAP1表达DNA。这些结果证明了NanoLuc®荧光素酶作为蛋白质功能报告剂用于监测应激反应通路中蛋白质稳定性的调节变化。此外，这些反应发生在2-3小时内，而传统的报告基因检测需要长达16小时才能达到最佳反应。HIF1A和NRF2的蛋白质稳定性报告提供了这些化学应激源靶点的近端读数，使药物发现期间的毒理学筛选具有高度精确的复合作用模式。

NanoLuc®荧光素酶还可以在高级细胞模型中应用蛋白质稳定性传感器。诱导多能干细胞(iPSC)来源的心肌细胞是研究缺血性疾病中HIF1A信号的有吸引力的细胞模型(2)。如图4,Panel A所示，在瞬时转染HIF1A- nanoluc®融合蛋白的iCell®心肌细胞中，可以监测HIF1A水平的诱导。脯氨酰羟化酶抑制剂如IOX2, CoCl2, ML-228和1,10 -菲罗啉在仅3小时的刺激后均诱导HIF1A-NanoLuc®蛋白的剂量依赖性增加。这些结果与使用缺氧反应元件(HRE-luc2P)萤火虫报告基因检测的结果一致，经过6小时的刺激(图4，面板B)。在iCell®心肌细胞中应用HIF1A- nanoluc®稳定性传感器，为研究HIF1A信号提供了一个与生理学相关的细胞环境中优雅的检测读数。

作为一种蛋白质功能报告器，NanoLuc®荧光素酶还可以定量测量内源性表达的遗传位点的蛋白质水平。由于过表达感兴趣的蛋白可能导致检测伪影，在内源性水平表达目标蛋白的能力可能是可取的。然而，当目标蛋白是在内源性水平产生时，特别是当目标蛋白自然不稳定时，使用灵敏度有限的报告器就会面临重大挑战。为了探索NanoLuc®荧光素酶作为内源性蛋白质稳定性报告者的效用，Horizon的专利GENESIS™平台被用于将NanoLuc®基因引入特定的染色体位点，如HIF1A或NRF2的框架蛋白融合。

如图5所示，用NanoLuc®工程的HCT116细胞与HIF1A的单一等位基因帧内融合，可用于监测用1,10邻菲罗啉治疗后HIF1A水平的诱导变化。采用类似NRF2-NanoLuc融合工程的HCT116细胞对叔丁基对苯二酚(tBHQ)具有剂量和时间依赖性反应。这些结果验证了NanoLuc®荧光素酶在不需要过表达的情况下作为蛋白质稳定性动态的超灵敏报告剂的使用。

Promega提供了一套NanoLuc融合载体，用于细胞内蛋白质稳定性分析。这些载体可使用标准限制性酶克隆或Promega的便捷Flexi®克隆系统实现与NanoLuc®荧光素酶融合的n端和c端亚克隆(表2)。Flexi®系统兼容载体可促进从ORF克隆基因板中转移感兴趣的基因，如Promega“找到我的基因“祭。

有关NanoLuc®融合载体的更多信息，包括HIF1A-NanoLuc®和NRF2-NanoLuc®表达载体，请访问:www.promega.com/leyu乐鱼网products/pm/nanoluc-redefining-reporter-assays/

1. 西蒙斯，S.O，范，C.Y.和拉马巴德兰，R. (2009)细胞应激反应通路系统是毒理学筛选中的哨兵系统。Toxicol。Sci. 111, 202-25。
2. Zhi D, Irvin MR, Gu CC, Stoddard AJ, Lorier R, Matter A, Rao DC, Srinivasasainagendra V, Tiwari HK, Turner A, Broeckel U, Arnett DK。(2012年5月)全外显子组测序和ipsc衍生的心肌细胞模型为左心室肥厚的基因发现提供了一个强大的平台。前面。3:92麝猫。