使用GloMax®Discover系统上的NanoDLR™和CellTiter Fluor™测定单孔蛋白质水平、转录激活和细胞活力的多重测量
Promega公司
出版时间:2017年1月;tpub_179
摘要
在这里，我们描述了蛋白质水平、转录激活和细胞活力的多重检测。蛋白质融合到非常小的，强烈发光的NanoLuc®荧光素酶在双荧光素酶报告试验中定量，萤火虫荧光素酶作为转录报告，以及活力的荧光测量。我们应用这个实验来了解细胞对缺氧反应的生物学基础。
我们的目标是设计一种多重检测方法，能够随着时间的推移进行简单的测量:1)HIF1A蛋白积累;2) hif1a介导的来自缺氧反应元件(HRE)的转录激活;3)复合处理后细胞活力的变化。由于其体积小且发光明亮，NanoLuc®荧光素酶是测量蛋白质水平变化的理想融合伙伴。NanoLuc®检测的高灵敏度意味着蛋白质可以在更低的生理水平上表达，产生更多的生物学相关结果。
双报告因子分析提供了一种监测同一细胞群中多个通路点的方法。在一种常见的实验格式中，一个荧光素酶被用作调控启动子的转录激活的报告子，而另一个则代表从组成启动子表达的阴性对照。这种双重分析可以通过允许同一井内的数据规范化来提高数据质量。
Nano-Glo®双荧光素酶报告器(NanoDLR™)检测系统允许使用简单的add-read-add-read协议对同一样品中的NanoLuc®荧光素酶(Nluc)和萤火虫荧光素酶(Fluc)进行敏感和顺序监测。初始Fluc信号的有效猝灭与明亮的Nluc信号相结合，使两种报告具有高灵敏度。如果需要从每个处理中获得更多的数据，NanoDLR™检测可用于两个实验报告基因的多重复用，如NanoLuc®融合蛋白与萤火虫报告基因检测。
NanoDLR™发光的测量可以进一步与使用CellTiter-Fluor™细胞活力测定法的细胞活力荧光测量相复用，从单个样本中获得更完整的整体细胞反应图谱。在本试验中，与活细胞相关的蛋白水解活性将底物转化为与活细胞数量成正比的荧光产物。在加入溶解的NanoDLR™试剂之前，可以立即进行该检测。
GloMax®Discover简化了分析复用和基于注射器的协议，实现了简单的时间过程实验。
这是一个测量HIF1A-Nluc积累和HRE-luc2P在缺氧模拟物处理后的活化的样本方案。
由用户提供的材料
可从Promega下载:
- Nano-Glo®双荧光素酶报告物(NanoDLR™)检测系统(Cat。# N1610)
- GloMAX®Discover系统(Cat。# GM3000)
- FuGENE®HD转染试剂(Cat;# E2311)
- CellTiter-Fluor™细胞活力测定法(Cat。# E6080)
- pGL4.42 [luc2P/HRE/Hygro] Vector(猫;# E4001)
- pNLF1-HIF1A [CMV/neo]载体(Cat;# N1381)
- 白色，96孔板(康宁猫。# 3917)
- 1,10-邻菲罗啉(Aldrich Cat。# 131377)
- HEK293细胞
- Thermo Fisher猫。# 11995065)
- 的边后卫
- Opti-MEM®I (Thermo Fisher Cat.#11058021)
- HEK293细胞经分离、复悬、离心后复悬至1.5 × 105细胞/ml DMEM + 10%胎牛血清。
- 将20µg的pGL4.42 [luc2P/HRE/Hygro]载体，20ng的pNLF1-HIF1A [CMV/neo]载体和60µl的FuGENE®HD试剂混合在2ml的Opti-MEM®I中，创建转染复合物。
- 将转染复合物加入1.5 × 10的40ml中5HEK293细胞/ml，每孔72µl混合分配至10 × 96孔板。在37°C + 5% CO中孵育18小时2孵化器。
- 在Opti-MEM®I中生成10X浓度的1,10-菲罗啉系列稀释液，得到以下最终浓度:0、0.1、0.32、1、3.2、10、32和100 μ M。在时间零点时，将8µl的给定10X原液添加到适当的孔(N=6)中，放置在37°C + 5% CO中2孵化器。
- 准备ONE-Glo™EX和NanoDLR™Stop & Glo®试剂。在GloMax®Discover仪器上，1号主注入器使用ONE-Glo™EX试剂，2号主注入器使用NanoDLR™Stop & Glo®试剂。
- 在菲罗啉处理后的0、0.5、1、2、3、4、6和8小时，从培养箱中取出给定的平板，冷却至室温并放置在GloMax®Discover中。
- 执行NanoDLR™喷射器protocol注入两种试剂，并以自动方式测量发光(在技术手册中描述)# TM426）.
- 为了在复合处理4和6小时后监测复合毒性，在每孔中加入20µl的CellTiter-Fluor™试剂(作为5X试剂)，在37°C培养箱中培养1小时。
- 冷却板至室温，放置在GloMax®Discover。执行CellTiter-Fluor™协议(如技术公报所述# TB371，其后是NanoDLR™注射器协议(技术手册)# TM426）.
图1。对HEK293细胞用菲罗啉处理后的剂量反应和时间过程。面板。单时间点的剂量反应显示了HIF1A-Nluc融合的菲咯啉依赖性积累和相应的缺氧反应元件的激活(通过报告基因luc2P测量)。面板B。在添加100 μ M的菲罗啉后，绘制了两种报告细胞与未处理细胞相比发光的折叠式变化。时间过程突出了发生在HIF1A积累和它随后在细胞核中转录激活之间的滞后。面板C。通过使用CellTiter-Fluor™培养细胞，并在执行NanoDLR™检测之前测量荧光，可以将额外的细胞活力测量与NanoDLR™进行复用。在这种情况下，CellTiter-Fluor™测量结果表明，在这个时间点，在较高浓度的菲罗啉下，有少量毒性。误差条表示6次重复的S.E.M.。
结论
对于许多胁迫响应途径中的转录因子来说，调控降解是控制其活性的关键机制。我们已经使用Nano-Glo®双荧光素酶报告基因(NanoDLR™)检测多重测量了蛋白质积累与NanoLuc融合蛋白，以及转录因子在其调控启动子上的活性与luc2P报告基因。在用菲罗啉处理后HIF1A活性的情况下，时间过程表明转录因子的积累和下游靶点的激活之间存在滞后。NanoLuc®荧光素酶的亮度使表达达到生理相关水平，这对观察正确的生物反应很重要。特别是当NanoDLR™被用于测量两个动态报告时，而不是只有一个本构控制时，为了监测被测化合物引起的毒性，包括细胞活力测定可能是有用的。这可以通过将发光检测与CellTiter-Fluor™检测的荧光读数进行复用来实现。底物与细胞一起在培养基中培养，一种与活细胞相关的酶将其转化为荧光产物。在加入NanoDLR™试剂之前，可以立即在GloMax®Discover仪器上测量荧光。Discover上的双自动注入器可用于自动化各种试剂的添加和测量。这大大简化了这里描述的分析格式，其中包含复合剂量反应的单个分析板从培养箱中取出，并在特定的时间点放入光度计。 These multiplexed measurements of protein abundance, gene expression, and cell viability can greatly increase the amount of information obtained from a single sample.
阅读多路分析并不需要花费你所有的时间。如何引用这篇文章
科学文体，2006年第7版
Eggers, C, Landreman, a .使用GloMax®Discover系统上的NanoDLR™和CellTiter Fluor™测定单孔蛋白质水平、转录激活和细胞活力的多重测量。【互联网】2017年1月;tpub_179。[引用:年，月，日]。下载地址:https://www.promega.com/resources/p乐鱼体育是什么ubhub/multiplexing-protein-levels-transcription-and-cell-viability-with-nanodlr-and-celltiter-fluor/
美国医学协会，风格手册，第10版，2007年
Eggers, C, Landreman, a .使用GloMax®Discover系统上的NanoDLR™和CellTiter Fluor™测定单孔蛋白质水平、转录激活和细胞活力的多重测量。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/multiplexing-protein-levels-transcription-and-cell-viability-with-nanodlr-and-celltiter-fluor/ 2017年1月更新;tpub_179。访问月日，年。
Dual-Luciferase, FuGENE, GloMax, Nano-Glo, NanoLuc和Stop & Glo是Promega Corporation的注册商标。
CellTiter-Fluor, ONE-Glo和NanoDLR是Promega公司的商标。
Opti-MEM是Life Technologies, Inc.的注册商标。
