通过GSH/GSSG-Glo™检测臭氧诱导的细胞氧化还原平衡变化

Madeleine Chalfant和Karen Bernd
戴维森学院生物系，北卡罗来纳州戴维森28035
出版时间:2011

摘要

臭氧暴露通过若干机制造成肺损伤，可能导致在臭氧水平高的城市地区可见的有害健康影响。我们感兴趣的是了解肺细胞响应和介导臭氧引起的损伤的机制。在这里，我们展示了Promega GSH/GSSG-Glo™检测在实验中评估细胞氧化还原状态的灵活性，在这些实验中，暴露于不同水平的测试化合物不能在同一个96孔板中发生。

简介

流行病学研究表明肺部疾病与臭氧暴露之间存在关联。城市地区环境臭氧水平的稳步上升与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘和肺癌发病率的增加有关，而这些疾病的患者在环境臭氧水平较高的日子里会出现更严重的症状^{(1）（2）（3）}．另有研究表明，臭氧暴露可诱发急性和慢性肺部炎症，这两种炎症都被认为是慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘和特发性肺纤维化(IPF)的致病过程的一部分。^（4）．环境压力源，如臭氧，对生理反应的影响已经在全生物体研究中概述。肺部臭氧暴露可引起上皮衬液和细胞表面的脂质和蛋白质过氧化，增加细胞内的活性氧化物种(ROS)，引起DNA损伤和细胞死亡^{(1）（5）(6）(7）}．此外，全生物研究记录了臭氧暴露后谷胱甘肽的产生增加。这种抗氧化剂的上调表达被假设为最大限度地减少强氧化剂的有害影响，并恢复氧化还原稳态^{（8）（9)（10）}．因此，臭氧化对细胞健康的影响可以通过监测总谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)的比例来推断。全动物研究的优势在于实验系统包含了在体内看到的各种相互作用。然而，由于氧化剂与非靶细胞类型的相互作用，这些模型可能会混淆分析。细胞培养研究可以更彻底地研究特定于关键靶细胞类型的相互作用和反应。II型肺泡细胞是气体交换和肺功能不可或缺的部位，但它们对臭氧氧化的反应尚未完全确定。为了模拟环境氧化剂在培养中对这些细胞的影响，我们检测了臭氧对大鼠II型肺细胞(L2细胞)氧化还原稳态的影响。

结果

L2细胞在10点播种⁴细胞/孔，在3.5L/分钟CO中暴露1小时₂O_3.(O_3.按照EPA的定义)，然后让其恢复24小时。作为细胞健康和细胞氧化还原状态的测量，总谷胱甘肽和GSSG水平使用GSH/GSSG- glo™测定(猫。# V6611)．检测到的总谷胱甘肽水平的变化与之前的全动物研究一致，这表明肺泡细胞利用谷胱甘肽来减轻臭氧暴露的影响^（11）．我们的数据与全动物报告的不同之处在于:a)在受控条件下只分析了单一细胞类型;b)重点是肺细胞，而不是支气管或气管细胞;c)臭氧暴露在与环境相关的水平内。我们发现暴露于350ppb O_3.总谷胱甘肽有轻微但有统计学意义的增加(图1,a组;p < 0.0001)。进一步分析表明，O_3.暴露导致氧化谷胱甘肽浓度增加两倍(图1，图B)，在350ppb臭氧存在时，总谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽的比例下降了50%(图1，图C)。

先天的，我们提出了两种假设来描述肺泡细胞对氧化应激的潜在反应。在第一种情况下，臭氧暴露导致细胞抗氧化剂的增加，因此谷胱甘肽的总量增加。由于细胞中谷胱甘肽的含量通常是GSSG的100倍，臭氧化既不会影响谷胱甘肽与GSSG的相对比例，也会导致其略有增加。第二个假设也依赖于谷胱甘肽:谷胱甘肽的比例，指出因为谷胱甘肽过量，臭氧暴露不会改变谷胱甘肽的绝对数量，只会改变氧化形式的百分比。我们的数据表明，大鼠II型肺细胞使用这两种策略的组合做出反应。暴露于危险水平的臭氧会导致细胞质谷胱甘肽总水平的小幅增加(+7%)和氧化谷胱甘肽的大幅增加(215%)。这些变化的意义和规模值得注意。文献中的研究通常只报告总谷胱甘肽水平(并且使用了不幸的简称，称为谷胱甘肽而不是总谷胱甘肽)，这掩盖了关于谷胱甘肽:谷胱甘肽平衡的潜在重要数据。由于GSH/GSSG-Glo™检测总谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽，从每次实验中收集更多信息，并开发更完整的模型。

在臭氧暴露研究中，通过将细胞暴露在不同物理位置的不同气体环境中来达到实验条件。因此，组成单一实验的不同气体处理不能在96个井板的相邻井中进行。因此，至关重要的是，所进行的生化分析是灵活的，并包括内部控制，以便可以在不同时间处理的细胞之间进行数据比较，以及在不同的运行期间。GSH/GSSG-Glo检测方法提供了一种直接的方法来检测细胞氧化还原状态，适用于这种类型的实验设计。

GSH/GSSG-Glo检测的其他优点是，所有步骤都发生在细胞培养孔中，减少了在刮痧或胰蛋白酶化过程中可能发生的压力，以释放细胞和操作过程中的样品损失。发光信号与样品中谷胱甘肽的量成正比，并稳定3小时，允许数据收集方案的灵活性。此外，与现有的其他测定方法不同，该测定方法包括测量GSSG和总谷胱甘肽所需的所有试剂，并且该测定方法直接测定井中的GSSG水平，而不需要额外的去蛋白步骤、提取或HLPC分离。

快速和简单的方案增加了生化分析的灵活性，可在单一臭氧暴露设置期间执行。事实上，GSH/GSSG-Glo实验可以在ApoTox-Glo实验的1.5小时潜伏期内使用相同的细胞群在平行孔中进行，ApoTox-Glo实验通过测量活细胞特异性的蛋白酶活性来评估同一细胞群中的细胞活力、细胞毒性和凋亡事件，蛋白酶活性从失去膜完整性的细胞和caspase-3/7活性中释放。这种方法节省了额外的时间，并且对生化分析的数据趋势有信心，因为所使用的细胞都是同时镀金、暴露和处理的。

结论

通过将L2细胞暴露于350ppb O_3.使用GSH/GSSG-Glo™检测来表征变化，我们确定II型肺泡细胞对氧化应激的反应包括细胞质谷胱甘肽总量和氧化状态的变化。我们的研究结果表明，对肺泡细胞氧化还原稳态机制的全面描述需要关注所涉及成分的绝对浓度和相对浓度。GSH/GSSG-Glo™测定总谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽水平，非常容易使用，可以在细胞培养处理过的96孔板中进行，使其成为需要技术上困难的暴露参数的实验的理想选择，高通量或多路复用将增强分析。

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文章引用

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如何引用这篇文章

科学文体，2006年第7版

Chalfant, M.和Bernd, K.通过GSH/GSSG-Glo™检测臭氧诱导的细胞氧化还原平衡变化。(互联网)2011。[引:年、月、日]。可从:https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/tpub_059-detecting-ozone-induced-changes-in-cellular-redox-balance-via-gsh-gssg-glo-assay/

美国医学协会，《文体手册》，2007年第十版

Chalfant, M.和Bernd, K.通过GSH/GSSG-Glo™检测臭氧诱导的细胞氧化还原平衡变化。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/tpub_059-detecting-ozone-induced-changes-in-cellular-redox-balance-via-gsh-gssg-glo-assay/ 2011年更新。访问月、日、年。

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