使用NanoLuc®荧光素酶和GloMax®Discover系统检测生理水平的HIF1α表达

Doug Wieczorek
Promega公司
出版时间:2014 / 11 (tpub_156)

摘要

在这里，我们展示了NanoLuc®荧光素酶在使用缺氧诱导因子1α表达(HIF1α)作为实验系统测量生理相关水平的基因表达的实用性，并展示了GloMax®Discover系统的检测。

需要更加敏感的记者制度

长期以来，报告基因一直被用作一种检测特定基因表达的方法。导致基因过表达的构建可能导致细胞反应的改变或其他可能影响报告分析结果解释的有害影响。因此，测量生理相关水平的基因表达变得很重要。然而，表达弱的基因很难测量，需要更灵敏的系统进行分析。随着锌指、TALEN和CRISPR/Cas基因组编辑方法的可用性，以及像NanoLuc®Luciferase这样的小而灵敏的报告器，设计报告分析来忠实地检测内源性基因表达越来越容易实现。在本报告中，我们使用NanoLuc®萤光素酶和GloMax®Discover系统检测一种这样的报告试剂在生理水平上检测HIF1α(缺氧诱导因子1α亚基)表达的能力。

诱导细胞对低氧应激的反应

HCT-116细胞含有HIF1α与NanoLuc®报告基因的框内融合[X-MAN™HIF1A (+NanoLuc®/+)蛋白报告器］^(1）在完全培养基(RPMI 1640培养基+ 10% FBS + 300µg/ml G418)中生长。用PBS洗涤细胞，胰酶化，稀释至2.22 × 10⁵细胞/ml完全培养基(20,000细胞/90µl)。将细胞在完全培养基中连续稀释2倍，最终浓度为10K细胞/90µl, 5K细胞/90µl, 2.5 × 10^3.细胞/ 90µl。每孔90μl的细胞被镀成2个纯白色96孔板，每种浓度。细胞在37°C, 5% CO中孵育约20小时₂孵化器。

10mM 1,10 -菲罗啉原液在DMSO中连续稀释，250mM col原液₂在无核酸酶水中连续稀释，包括每种化合物的整车对照。在RPMI 1640培养基+ 10% FBS中进一步稀释1:10至10X浓度。将每种稀释剂的总体积10 l添加到四个96孔板的每个细胞数量中，在37°C, 5% CO中孵育3小时₂孵化器。盘子一式两份。暴露3小时后，在每孔中加入100μl Nano-Glo®试剂。简单混合，室温下孵育10分钟，并在GloMax®Discover系统上读取。

在生理水平检测HIF1α的表达

在用菲罗啉和CoCl治疗后₂HCT-116细胞包含HIF1α与NanoLuc®报告基因的帧内融合，可以监测HIF1α的诱导变化。随着化合物浓度的增加，细胞对这两种化合物的反应呈剂量依赖性，这可以从NanoLuc®荧光素酶表达的增加中得到证明(图1和2)。对于菲罗啉，诱导增加到~12.5 μ M。较高的浓度导致荧光素酶诱导没有增加。对于CoCl₂，诱导率增加至~92.6 μ M。高浓度导致荧光素酶诱导明显下降，可能是复合毒性和细胞死亡的结果。未诱导的NanoLuc®荧光素酶在不同细胞数下的表达也显示在图3中，表明GloMax®Discover系统在生理水平上检测HIF1α- NanoLuc®荧光素酶的能力。在该细胞系的验证过程中，对含有HIFα被NanoLuc®荧光素酶取代(未融合)结构的细胞进行了测试，以确保该蛋白被适当调节，且诱导不是转录变化的结果^(1）．

总结

GloMax®Discover系统与NanoLuc®荧光素酶技术相结合，为强表达和弱表达的生物发光报告物提供了优越的发光灵敏度和动态范围。使用GloMax®Discover可以监测包含HIF1α与NanoLuc®报告基因框内融合的细胞中诱导的HIF1α变化，而仪器的灵敏度允许在只有2500个培养细胞的生理水平上检测未诱导的HIF1α表达。随着锌指、TALEN和CRISP/Cas9基因编辑方法等基因组编辑工具的出现，设计用于检测内源性NanoLuc®luciferase标记蛋白水平的报告分析越来越容易实现。

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文章引用

1. (2014年11月访问)X-MAN™报告套件地平线上发现

如何引用这篇文章

科学文体，2006年第7版

使用NanoLuc®萤光素酶和GloMax®Discover系统在生理水平检测HIF1α表达。[互联网]2014年11月(tpub_156)。[引用:年，月，日]。下载地址:https://www.promega.com/resources/p乐鱼体育是什么ubhub/tpub_156-detection-of-hif1alpha-expression-at-physiological-levels-using-nanoluc-luciferase/

美国医学协会，风格手册，第10版，2007年

使用NanoLuc®萤光素酶和GloMax®Discover系统在生理水平检测HIF1α表达。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/tpub_156-detection-of-hif1alpha-expression-at-physiological-levels-using-nanoluc-luciferase/ 2014年11月更新(tpub_156)。访问月日，年。

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