更容易检测炎症小体激活
1*目前地址:Luminex Corporation，2Promega生物科学
出版时间:2016年7月;tpub174
摘要
先天免疫细胞通过炎症小体激活对各种致病刺激作出反应。随着人们越来越关注炎症在人类疾病中的作用，测量炎症小体激活的能力将变得越来越有价值。测量炎症小体激活的标准方法既费力又耗时。Caspase-Glo®1炎症小体检测是检测炎症小体活性的传统方法的更好选择，它提供了更容易的，直接检测微孔板中Caspase-1活性的方法，是复用，自动化高通量筛选和使用附加下游检测的理想选择。
炎症小体是由多种炎症刺激引起的蛋白质复合体。先天免疫细胞通过形成各种炎症小体和激活caspase-1来应对病原体和其他危险信号。Caspase-1的激活导致细胞因子IL-1β和IL-18的加工和释放，以及一种称为焦亡的程序性细胞死亡的免疫原性形式。
虽然先天免疫系统已经进化为一种对感染的快速防御机制，而炎症是对感染的保护性反应，但调节失调可能导致慢性炎症性疾病。慢性炎症与许多疾病有关，包括哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠综合征、阿尔茨海默氏症、二型糖尿病和心脏病。随着人们越来越关注炎症在人类疾病中的作用，了解炎症小体的作用并有能力测量炎症小体激活将变得越来越有价值。
测量炎症小体激活的挑战
炎症小体活化通常用Western Blot或ELISA检测。虽然这些都是标准方法，但都是繁琐和耗时的，可能需要制作裂解液或使用无血清上清。其他缺点包括caspase-1抗体质量的变化和elisa动态范围的限制。更重要的是，Western blots和elisa不一定监测活性酶。用Western blot检测炎症小体的活性可能会被遗漏，因为caspase-1的寡聚而不是裂解是活性所必需的(1）．ELISA分析释放的IL-1β作为炎症小体激活的标记物可因IL-1β而复杂化这可能被其他蛋白酶在细胞外处理（2）或抗体与前il -1β交叉反应，当有细胞毒性时可释放。
一个更好的选择
易用性
Caspase-Glo®1炎症小体检测是检测炎症小体活性的传统方法的更好选择。简单的“添加-混合-测量”协议省去了Western blot和ELISA分析所需的细胞清洗、培养基去除和多个移液步骤。Caspase-Glo®1炎症小体试验可以直接测量微孔板中培养的细胞或培养基中的caspase-1活性。通过测量从转移的培养基中释放的活性caspase-1，可以保存生物样品用于下游分析和其他测定。
图1。Caspase-Glo®1炎症小体分析流程直接检测
Caspase-Glo®1炎症小体检测通过直接监测和选择性测量激活的caspase-1来评估炎症小体激活。Caspase-Glo®1试剂含有z - wehd -氨基荧光素，这是一种选择性底物，足够敏感，可以检测细胞中的caspase-1活性。Caspase-1裂解底物释放氨基荧光素，这是一种荧光素酶的底物，导致荧光素酶反应和光的产生。
图2。Caspase-Glo®1炎症小体分析化学。随着z - wehd -氨基荧光素底物的caspase裂解，一个荧光素酶(氨基荧光素)底物被释放，导致荧光素酶反应和光的产生。
MG-132的加入可以抑制非特异性蛋白酶体的活性，从而可以直接检测caspase-1的活性．由于该方法只检测催化活性caspase-1，因此可以确定炎症小体激活和失活的精确时间过程。该方法还能区分炎症小体激活和由此产生的焦亡与细胞凋亡或坏死(图4)。在平行样品中使用Ac-YVAD-CHO caspase-1抑制剂证实活性是caspase-1特异性的。Ac-YVAD-CHO抑制所有caspase-1信号，但不抑制其他交叉反应的caspase，如caspase 3和caspase 6，它们都与凋亡有关。因此，被YVAD-CHO抑制的信号表明caspase-1活性，而不被YVAD-CHO抑制的信号则表明另一种caspase活性。
图3。Caspase-1活性区别于其他caspase。在125pM下，使用z - wehd -氨基荧光素底物(添加Ac-YVAD-CHO Inhibitor或不添加Ac-YVAD-CHO Inhibitor)测定10个caspase。caspase -11是唯一的小鼠caspase;其他人都是人类。caspase -8也是一种非典型炎症性caspase。百分比表示Ac-YVAD-CHO抑制剂的抑制率。
图4。Caspase-Glo®1炎症小体检测与细胞毒性检测相结合，可区分凋亡、焦亡和坏死。面板。[凋亡vs炎症小体激活]THP-1细胞生长在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37°C和5% CO培养箱中2分别用凋亡诱导剂阿霉素、蚜虫霉素、紫杉醇和嘌呤霉素处理18 h。第2个培养液分别用炎症小体诱变剂奈格霉素(20μM)和α-溶血素(2μg/ml)处理THP-1细胞2h或用离子霉素(100μM)处理THP-1细胞2h诱导坏死。在Caspase-Glo®1试剂中加入2μM的YVAD-CHO或VEID-CHO抑制剂，最终浓度为1μ m。60分钟后使用GloMax®Multi+检测系统测量发光。YVAD-CHO的抑制表明酶活性可归因于caspase-1，而VEID-CHO的抑制表明凋亡caspase活性，而不是caspase-1。面板B。【坏死vs炎症小体激活】CellTox™绿色细胞毒性试剂与尼日尔霉素、α-溶血素和离子霉素同时添加到细胞中，并在添加Caspase-Glo®1试剂之前监测荧光(细胞毒性)。经处理后荧光信号增加表明膜通透性和细胞死亡。
井内检测和多路复用
该方法灵敏度高，背景低，可用于微孔板培养的细胞或细胞培养上清。此外，您可以与其他兼容的检测(例如，CellTox™绿色细胞毒性检测)进行同孔复用。多路复用可以通过监测细胞死亡和细胞因子释放来节省时间和区分caspase-1激活的不同结果。检测到caspase-1激活伴随细胞死亡提示细胞焦亡。你也可以用IL-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)进行多重检测，方法是去除一部分培养基，测量释放的IL-1β，然后在剩余的细胞和培养基上进行caspase-1检测。
图5。Caspase-Glo®1炎症小体检测与细胞活力和细胞死亡检测相结合。THP-1细胞在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，在37°C和5% CO培养箱中培养2．细胞以5 × 10的倍率添加到平板上5在96孔板上用PMA (20nM, 3天)分化，然后用鞭毛蛋白(1μg/ml, 1小时)或奈革霉素(20μM, 2小时)处理。面板。取一半培养基(50μl)置于另一个平板上，每孔分别加入50μl Caspase-Glo®1 Reagent或Caspase-Glo®1 YVAD-CHO Reagent。30分钟后记录发光。然后，按照制造商的说明，使用CellTox™绿色细胞毒性试验、CellTiter-Glo®发光细胞活力试验或RealTime-Glo™MT细胞活力试验对含有细胞和一半培养基的原始培养皿进行检测。面板B。细胞中加入CellTox™绿色试剂，90分钟后记录荧光。面板C。用CellTiter-Glo®或RealTime-Glo™MT细胞活力测定法监测细胞活力。分别在10分钟和90分钟记录发光。使用GloMax®Multi+检测系统记录所有发光和荧光读数。
其他主要优点和特性
Caspase-Glo®1炎症小体分析是自动化高通量筛选的理想选择。在96井和384井的井眼格式中，同构协议可以实现简单的扩展和自动化。这种简便的caspase-1试验的高通量能力将允许您筛选炎症小体激活的调节剂。虽然仅在1小时后就可以测量发光，但Caspase-Glo®1试剂中的发光caspase-1信号是稳定的(半衰期>3小时)。这使您可以在几个小时内读取印版，并消除了对试剂注入的光度计的需要。
结论
测量炎症小体激活为理解许多与炎症相关的疾病提供了有价值的信息。目前监测炎症小体激活的方法可能是艰巨的，而且缺乏特异性。Caspase-Glo®1炎症小体检测为井内炎症小体激活检测提供了一种简单直接的方法，比传统方法具有更高的灵敏度和灵活性。
如何引用这篇文章
科学文体，2006年第7版
奥布莱恩等人。更容易检测炎症小体激活。2016年7月(互联网);tpub174。[引用:年，月，日]。可以从https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/tpub_174-easier-detection-of-inflammasome-activation/
美国医学协会，风格手册，第10版，2007年
奥布莱恩等人。更容易检测炎症小体激活。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/tpub_174-easier-detection-of-inflammasome-activation/ 2016年7月更新;tpub174。访问月日，年。
Caspase-Glo, CellTiter-Glo和GloMax是Promega公司的注册商标。
CellTox和Real-Time-Glo是Promega公司的商标。
