磁性生物打印肝细胞球状体的发光活力测定

¹普扬·k·德赛，¹休伯特曾,¹威廉•Haisler²布拉德·拉森和¹Glauco R. Souza
¹Nano3D生物科学公司，休斯顿，德克萨斯州²BioTek仪器公司，维诺斯基，佛蒙特州
出版时间:2017年9月;tpub_189

摘要

在这里，我们展示了用磁性3D生物打印打印肝细胞球体的能力，然后使用P450-Glo检测这些球体的代谢活性(CYP3A4)和活力^TMCellTiter-Glo®发光分析。我们还展示了一种新方法，适合在解冻后数小时内磁化未粘附的细胞或冷冻保存的细胞，而不是几天。我们使用该技术组装诱导多能干细胞衍生(iPS)肝细胞的球形，9天后与同期单层培养相比，iPS肝细胞显示出更好的基础和诱导CYP3A4代谢。

背景

常规肝细胞培养的局限性

肝细胞通常用于评估药物性肝损伤(DILI)的化合物。然而，传统的肝细胞单层和悬液在长期培养中容易失去表型和功能，如细胞色素P450 (CYP)代谢。这限制了它们在cypn介导的药物代谢和诱导实验中的应用。三维(3D)肝细胞培养已被证明可以改善这些培养以维持表型，如药物清除和CYP活性。此外，球体可以帮助重建原生组织环境比单层和悬浮培养更好。^(1）

原代肝细胞被认为是筛选肝毒性的金标准，但由于供体数量少，原代肝细胞存在大量差异，数量有限和遗传多样性。诱导多能干细胞衍生(iPS)肝细胞可能为这些问题提供了一个解决方案，有可能提供理论上无限的来源，具有更高的可重复性和更广泛的可能供体选择。

用于肝细胞培养的磁三维生物打印

磁性3D生物打印技术为3D细胞培养提供了一个快速、易用的平台。在磁性3D生物打印中，通过将生物兼容的纳米颗粒组件NanoShuttle™粘附到细胞的膜上来磁化细胞，然后使用温和的磁场聚合成球状。^（2）

该方法特别适用于肝细胞培养。与其他3D方法相比，它可以在数小时内实现球体聚集，大大缩短了形成所需的时间。磁力也可以使较小数量的细胞聚集到足够的密度，而在单层培养中需要较大数量的细胞才能达到融合。此外，由于磁化球体可以被磁力压住，样品的保留率大大提高。当在标准微孔板系统中使用非溶性分析时，这尤其有利，这需要通过移液管反复交换介质，同时保持培养以供将来的分析。磁性3D生物打印也可用于开发具有精细空间组织的共培养模型，这对那些寻求将非实质细胞(星状，库普弗)与肝细胞结合的人很有兴趣。磁性3D生物打印共培养已在主动脉瓣细胞、肺细胞和白色脂肪组织中得到证实。^{（3）（4）（5）}最后，磁性3D生物打印只需要磁铁和NanoShuttle™，并且很容易适应现有的细胞培养工作流程。总的来说，磁性3D生物打印在支持肝细胞球形的形成和培养方面比其他3D方法具有优势。

在这项研究中，我们用磁性3D生物打印技术生成了肝细胞球形。^(6）生物打印肝细胞的另一个挑战是它们是非粘附的，即使是“可镀”种群也往往只有<50%的镀膜效率，即解冻后。我们没有使用以前需要电镀细胞的磁化方法，而是开发了一种磁化非粘附细胞的新方法(图1)。因此，球体可以在不电镀的情况下进行生物打印，允许在解冻或收获后数小时内进行生物打印。NanoShuttle™非特异性结合粘附细胞和非粘附细胞，允许从相同的肝细胞群中获得更大的输出。

肝细胞球状物测定

我们使用P450-Glo™CYP3A4测定法(Cat.#V9001)和CellTiter-Glo®发光细胞活力测定法(Cat.#G7570)分别评估我们生物打印的肝细胞球形体的CYP活性和活力。

P450-Glo™检测方法通过向细胞提供特定的原荧光素底物并量化CYP450酶从该底物中裂解的荧光素量来评估CYP450培养物的活性。底物和反应产物是可渗透细胞的。leyu乐鱼网荧光素，一种稳定的副产物，扩散到培养基中，荧光素酶反应可以在一个单独的微皿中进行，该微皿中含有来自原始细胞培养板的等份培养基。这允许重复分析，而不影响培养和多路复用与细胞活力分析。

CellTiter-Glo®发光细胞活力测定法是一种终点活力测定法，可量化代谢活性细胞中ATP的含量。细胞被裂解，并从介质中读出发光。在培养结束时，当一个完整的培养可能不需要时，测量生存能力是有用的。

这些分析的一个挑战是试剂扩散到密集的肝细胞球体。为了克服这一限制，P450-Glo™和CellTiter-Glo®检测方案进行了调整，包括延长培养时间，以确保原荧光素或荧光素的扩散，并允许活性细胞的彻底裂解，分别更准确地测量ATP。

这些实验提供了简单、廉价的方法来评估磁性生物打印的肝细胞球形的活力和肝特异性功能。

材料与方法

肝细胞球状体的磁化和生物打印

诱导多能干细胞来源(iPS)肝细胞(rephepato™，ReproCELL)使用解冻介质按照供应商的协议进行解冻。为了磁化细胞进行球形培养，将细胞重悬在解冻介质中至1 x 10⁶细胞/ml离心管。NanoShuttle™-PL以1µl/10,000个细胞的速度加入并混合到溶液中。管子被放在一个轨道激振器在室温下摇2小时，以175rpm。然后，将细胞以10,000个细胞/孔的速度种植到细胞排斥384孔板(CELLSTAR®板，Greiner Bio-One)中，并放置在384孔磁驱动器上，该驱动器由384个圆柱形磁铁(外部尺寸= 0.0625英寸)组成，位于每个孔下。磁驱动将磁化的细胞聚集到阱底，促进细胞接触和粘附，使细胞形成并保持一致的结构，即使在去除磁场后(图1)。

对于单层培养，细胞被播种到细胞粘附的96孔板(CELLSTAR®板，Greiner Bio-One，)中，预涂有I型胶原蛋白(Sigma-Aldrich)，每孔7.5万个细胞。

肝细胞培养

ips肝细胞在解冻培养基中培养24小时，然后在维持培养基中再培养6天，以使表型成熟，在第3天和第5天交换。在此期间，球形培养物保持在磁体上，以确保细胞与细胞的接触并建立结构的完整性。对于椭球体，所有的介质交换都是利用一个磁驱动器进行的，一个“保持磁铁”，一个更大的圆柱形磁铁(外部尺寸= 0.125英寸)来保持椭球体，防止样品丢失。

CYP诱导试验

使用P450-Glo™CYP3A4荧光素- ipa法检测利福平暴露后CYP3A4诱导。第7天，维持培养基换成无血清诱导培养基。在1% DMSO中0-200µM加入利福平。暴露72小时后，将含有利福平的诱导培养基替换为William’s E培养基中的3 μ M Luciferin-IPA。培养皿孵育2小时后，用荧光素检测试剂将50%培养基转移到单独的白色微皿(Greiner Bio-One)中。将CellTiter-Glo®试剂加入原培养板中，孵育20分钟。在Synergy 4 (Biotek)上读取所有板的发光。

结果

在这项研究中，我们验证了磁3D生物打印作为一种快速组装和检测肝细胞球形的手段。ips -肝细胞在解冻后24小时内形成合格的球体，并在培养期间保持其结构和活力，即使在反复交换培养基后(图2)。

在第7天加入利福平72小时后，ips -肝细胞显示出明显高于单层细胞的CYP3A4活性诱导(p < 0.05)，基线值也高于单层细胞(图3)。当利福平浓度为200 μ M时，球形细胞CYP3A4活性增加8.87±1.22倍，单层细胞CYP3A4活性增加4.45±2.11倍。两种模型对利福平均表现出相似的细胞毒性敏感性₅₀3D为41.94 μ M, 2D为51.04 μ M。CYP3A4活性在利福平具有细胞毒性的剂量下并未表现出整体下降，而只是在其增加速度上有所下降。在高剂量下增加的诱导可能克服由于生存能力降低而造成的任何下降。当活力变化归一化时，球体培养显示出比对照组200 μ M利福平诱导55倍。

此外，这里使用的非粘附磁化方法显然为典型的镀金磁化方法提供了一种可行的替代方案，并且允许操纵悬浮细胞类型以及不需要中间2D培养的粘附细胞类型的3D培养。

结论

磁三维生物打印技术是一种组装和培养肝细胞球状体的可行方法。磁性生物打印的肝细胞球体易于形成，用于高通量测试，在长期培养中保持表型，易于处理，具有高样品保留率，适合现有的细胞培养工作流程。Promega发光实验提供了简单有效的方法来测量培养中多个时间点的肝细胞功能和活力。总的来说，我们证明了磁性3D生物打印可以满足高通量肝细胞检测的需求，以及细胞培养和基于细胞的分析的许多需求。

确认

这项工作得到了国家卫生研究院(NIH)小企业创新研究(SBIR)第一阶段和第二阶段拨款(R43ES024644)的支持，由国家环境卫生科学研究所(NIEHS)管理。

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文章引用

2. Souza,广义相对论et al。(2010)基于磁悬浮的三维组织培养。Nanotechnol性质。5, 291 - 6所示。
3. Daquinag,交流et al。(2013)基于磁性纳米颗粒的三维悬浮组织培养系统中的脂肪组织工程。组织中。C.方法19, 336 - 44。
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6. 德赛,P.K.et al。(2017)使用磁性3D细胞培养组装肝细胞球形CYP450抑制/诱导Int。理学。18, 1085年。

如何引用这篇文章

科学文体，2006年第7版

Desai, p.k.， Tseng, H.， Haisler, W.， Larson, B.和Souza, G.R.磁生物打印肝细胞球形的发光活力测定。【互联网】2017年9月;tpub_189。[引:年、月、日]。可从:https://www.promega.com/resources/pub乐鱼体育是什么hub/tpub_189-luminescent-viability-assays-for-magnetically-bioprinted-hepatocyte-spheroids/

美国医学协会，《文体手册》，2007年第十版

Desai, p.k.， Tseng, H.， Haisler, W.， Larson, B.和Souza, G.R.磁生物打印肝细胞球形的发光活力测定。Promega公司网站。https://www.promega.com/乐鱼体育是什么resources/pubhub/tpub_189-luminescent-viability-assays-for-magnetically-bioprinted-hepatocyte-spheroids/ 2017年9月更新;tpub_189。访问月、日、年。

CellTiter-Glo是Promega Corporation的注册商标。P450-Glo™是Promega Corporation的商标。